Giới thiệu chung về Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 452:2001
Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 452:2001 là văn bản kỹ thuật do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành, quy định quy trình chuẩn hóa trong việc phân tích cây trồng, cụ thể là phương pháp xác định hàm lượng Nitrat (NO3-) và Nitrit (NO2-). Đây là các chỉ tiêu hóa lý quan trọng giúp đánh giá chất lượng nông sản, mức độ an toàn thực phẩm và dư lượng đạm trong các loại cây trồng, đặc biệt là nhóm rau củ quả.
Phạm vi áp dụng và đối tượng phân tích
- Đối tượng áp dụng: Tiêu chuẩn này áp dụng tại các phòng thử nghiệm, cơ quan kiểm định chất lượng nông sản và các tổ chức, cá nhân thực hiện phân tích thành phần hóa học của cây trồng phục vụ nghiên cứu hoặc kiểm soát chất lượng.
- Mẫu phân tích: Các loại mẫu thực vật, bộ phận của cây trồng (lá, thân, củ, quả) ở dạng tươi hoặc đã được sấy khô và xử lý theo quy định kỹ thuật.
Nguyên lý của phương pháp xác định
Phương pháp xác định Nitrat và Nitrit trong cây trồng theo tiêu chuẩn này dựa trên các nguyên lý hóa học cơ bản sau:
- Chiết xuất: Sử dụng nước cất hoặc dung dịch chiết thích hợp để hòa tan hoàn toàn lượng Nitrat và Nitrit có trong mẫu cây trồng đã được đồng nhất hóa.
- Khử Nitrat thành Nitrit: Đối với việc xác định Nitrat, mẫu chiết sẽ được dẫn qua cột khử (thường là cột khử Cadmium bọc đồng) hoặc sử dụng tác nhân khử phù hợp để chuyển hóa toàn bộ ion Nitrat (NO3-) thành Nitrit (NO2-).
- Phản ứng tạo màu (Phản ứng Griess): Ion Nitrit (bao gồm cả lượng Nitrit có sẵn và lượng Nitrit được khử từ Nitrat) phản ứng với sulfanilamide trong môi trường axit để tạo thành muối diazonium. Muối này tiếp tục kết hợp với N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride (NEDD) tạo thành hợp chất màu hồng tím đặc trưng.
- Đo quang phổ: Tiến hành đo mật độ quang (độ hấp thụ ánh sáng) của dung dịch màu ở bước sóng xác định (thường khoảng 538 nm đến 540 nm) trên máy quang phổ để tính toán hàm lượng Nitrat và Nitrit dựa trên đường chuẩn.
Thiết bị, dụng cụ và hóa chất yêu cầu
- Thiết bị chính: Máy đo quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis), cân phân tích có độ chính xác cao (0,0001g), máy xay mẫu, máy lắc hoặc thiết bị khuấy từ.
- Dụng cụ thủy tinh: Bình định mức, pipet tự động, ống nghiệm, phễu lọc, giấy lọc chuyên dụng không chứa Nitrat và Nitrit.
- Hóa chất: Nước cất hai lần, các hóa chất tinh khiết phân tích (AR) bao gồm Sulfanilamide, N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride, Axit clohydric (HCl), Cadmium kim loại, Đồng sunfat (CuSO4), và các muối chuẩn Kali Nitrat (KNO3), Natri Nitrit (NaNO2) để xây dựng đường chuẩn.
Quy trình tiến hành phân tích
- Chuẩn bị mẫu: Mẫu cây trồng được làm sạch, thái nhỏ, đồng nhất hóa bằng máy xay. Đối với mẫu khô, tiến hành sấy ở nhiệt độ quy định và nghiền mịn qua rây.
- Quá trình chiết: Cân một lượng mẫu xác định, thêm nước cất ấm, lắc đều hoặc đun cách thủy để chiết xuất hoàn toàn Nitrat và Nitrit, sau đó lọc lấy dung dịch trong.
- Xác định Nitrit trực tiếp: Lấy một thể tích dung dịch lọc nhất định, thêm thuốc thử tạo màu, để yên trong thời gian quy định để phản ứng xảy ra hoàn toàn rồi đem đo mật độ quang.
- Xác định Nitrat (sau khi khử): Cho dung dịch lọc đi qua cột khử Cadmium để chuyển Nitrat thành Nitrit, sau đó tiến hành tạo màu và đo quang tương tự như xác định Nitrit.
- Xây dựng đường chuẩn: Chuẩn bị dãy dung dịch tiêu chuẩn Nitrat và Nitrit với các nồng độ biết trước, tiến hành tạo màu và đo mật độ quang để vẽ đồ thị đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và độ hấp thụ.
Tính toán và biểu thị kết quả
Hàm lượng Nitrat và Nitrit trong mẫu cây trồng được tính toán dựa vào công thức quy định trong tiêu chuẩn, căn cứ trên mật độ quang đo được, thể tích dịch chiết, hệ số pha loãng và khối lượng mẫu phân tích. Kết quả cuối cùng thường được biểu thị bằng miligam trên kilogam (mg/kg) tính theo mẫu tươi hoặc mẫu khô kiệt, giúp các nhà chuyên môn dễ dàng đánh giá so sánh với các tiêu chuẩn an toàn thực phẩm hiện hành.
PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITRAT VÀ NITRIT
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng nitrat và nitrit tổng số cho các mẫu cây trồng tươi.
Sử dụng lò vi sống hoà tan nhanh (chiết) nitrat và nitrit (NO3- NO2-) trong mẫu tươi bằng nước, đun vi sóng ở mức năng lượng cao.
Xác định hàm lượng nitrat bằng phương pháp trắc quang, dựa trên phản ứng của nitrat với axit disunfophenol tạo thành nitrofenoldisunfonic trong môi trường kiềm có mầu vàng đặc trưng, đo tại bước sóng 410nm.
Xác định hàm lượng nitrit bằng phương pháp trắc quang, dựa trên phản ứng của nitrit với axit sunfanilic và ( naphtylamin trong môi trường axit có mầu hồng, đo tại bước sóng 540nm.
3.1. Thiết bị
3.1.1. Máy quang phổ kế (Spectrophotometer)
3.1.2. Máy nghiền mẫu thực vật tươi
3.1.3. Cân phân tích độ chính xác 0,0002g
3.1.4. Lò vi sóng (Công xuất 850w, tần số hoạt động 2450MHz)
3.1.5. Nồi cách thuỷ.
3.1.5. Các loại cốc, bình định mức 50ml, 100ml, 250ml, 1000ml
3.2. Thuốc thử
3.2.1. Dung dịch axit phenoldisunfonic (*)
(*)Có thể tự chế tạo dung dịch axit phenoldisunfonic bằng cách: Hoà tan 25g phenol tinh khiết vào 150ml H2SO4 đặc (d= 1,84), thêm 75ml axit H2SO4 bốc khói. Đun nóng 2 giờ trong nước sôi, bảo quản trong lọ mầu tối. Cũng có thể hoà tan 30g phenol tinh khiết vào 200ml H2SO4 đặc (d= 1,84), lắc đều. Sau đó nối bình với ống sinh hàn hồi lưu và đun trong 6 giờ, bảo quản trong lọ mầu tối.
3.2.2. Dung dịch thuốc thử Griss (**)
10TCN 452-2001
(**) Thuốc thử Griss kiểu cũ-1: Pha dung dịch axit Sunfanilic: hoà tan 0,5g axit sunfanilic trong 150ml axit acetic 10%. Pha dung dịch ( naphtylamin: hoà tan 0,1g ( naphtylamin vào 20ml nước cất, khuấy đều, đun sôi dung dịch thu
được, để lắng trong, lọc lấy phần trong và thêm vào phần trong 150ml axit acetic 10% lắc đều, bảo quản trong lọ mầu tối.
Hoặc kiểu cũ -2: Hoà tan 150ml axit acetic 99% với 350ml nước, tiếp đó hoà tan thêm 0,10g Napthylamin và sau đó 0,30g axit Sunfanilic, khuấy tan và trộn đều.
(**) Thuốc thử Griss cải tiến: Gồm 2 dung dịch Sunfanylamit và N(1-naphtyl) etylen diamine dihydrroclorua (NED)
1/ Sunfanylamit: cân 5g sunfanylamit hoà tan trong bình định mức 500ml có chứa 50ml HCL đặc và 300ml nước cất. pha loãng đến 500ml bằng nước cất, lắc kỹ. dung dịch ổn định trong nhiều tháng.
2/ N(1-naphtyl) etylen diamine dihydrroclorua(NED): Cân 0,5g NED hoà tan trong 500ml nước cất, bảo quản trong bình tối mầu. Dung dịch không bền, thay thế hàng tháng hoặc khi chuyển sang mầu nâu.
3.2.3. Dung dịch tiêu chuẩn nitrat 10ppm
Cân chính xác 0,1631g KNO3 khô tinh khiết, hoà tan bằng nước và thêm nước đến 1000 ml trong bình định mức. Trộn đều dung dịch, thu được dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ 100mg/lít (100ppm), hoà loãng tiếp10 lần có dung dịch tiêu chuẩn nitrat 10ppm.
3.2.4. Dung dịch tiêu chuẩn nitrit 5ppm
Cân chính xác 0,375g NaNO2 tinh khiết và khô, hoà tan bằng nước thành 1 lít dung dịch, thu được dung dịch tiêu chuẩn 250ppm NO2-. Pha loãng 50 lần để có dung dịch tiêu chuẩn 5 ppm NO2-.
3.2.5. Dung dịch NH4OH(1:1). Hoặc NaOH 10%
3.2.6. Nước không có NO3- và NO2-, độ dẫn điện nhỏ hơn 2(S/cm pH 5,6-7,0
4. Phương pháp chiết nitrat và nitrit bằng lò vi sóng( *** )
4.1. Chiết NO3- và NO2- bằng lò vi sóng có thể loại trừ được hầu hết các ảnh hưởng xấu tới kết quả phân tích nitrat và nitrit. Cách làm như sau:
4.2. thái nhỏ trộn đều mẫu, cân 10g mẫu cho vào cốc 250ml, thêm nước cất đến khoảng 200ml.
4.3. Cho cốc vào lò vi sóng và tiến hành đun vi sóng ở mức năng lượng cao 100% trong thời gian 7 phút (Cũng có thể đun ở mức năng lượng 70% với thời gian 12 phút).
Lấy ra để nguội, lọc bỏ bã và định mức dịch lọc bằng nước cất đến 200ml. Lấy 10ml để xác định NO3 và 10ml để xác định NO2
(***) Tham khảo tài liệu “Nghiên cứu xác định hàm lượng NO3,NO2” của Phạm Huy Đồng, Trần Tử Hiếu, Ngô Huy Du-2000 )
Xây dựng đường chuẩn NO3. Dẫy tiêu chuẩn 0-1ppm NO3
5.1.1 Chuẩn bị một dẫy cốc 250ml, thêm vào mỗi cốc một lượng dung dịch nitrat tiêu chuẩn nồng độ 10mg/l theo thứ tự lần lượt 0,0 ; 0,5 ; 1,0 ; 2,0 ; 3,0 ; 4,0 ; 5,0 ml.
Đun cách thuỷ cho bay hơi đến khô cạn không cháy, để nguội (****)
5.1.2. (****) Có thể cô cạn bằng lò vi sóng ở mức năng lượng thấp 30%, thời gian mất khoảng 7-10 phút.
5.1.3. Thêm vào mỗi cốc 1ml dung dịch axit phenoldisunfonic và lắc mạnh để cho phản ứng sẩy ra nhanh chóng.
5.1.4. Để yên trong 10 phút, sau đó thêm mỗi cốc khoảng 20ml nước.
Cẩn thận thêm vào mỗi cốc 8ml dung dịch NH4OH (1:1) để cho pH nằm trong khoảng 10-11. (*****)
5.1.5. (*****) Có thể trung hoà dung dịch bằng cách nhỏ từng giọt dung dịch NaOH 10% (thử bằng giấy quỳ tím). Dung dịch sẽ chuyển màu vàng (dư một ít NaOH không ảnh hưởng đến màu của dung dịch.
5.1.6. Chuyển dung dịch trong cốc vào bình định mức 50ml và định mức đến vạch, lắc kỹ.
Đo độ hấp thụ quang của dung dịch ở bước sống 410nm. Sau đó biểu diễn lên đồ thị ta được đường chuẩn có NO3 có nồng độ từ 0-1ppm NO3
5.2.1. Đo mẫu:
5.2.2. Chuẩn bị cốc 250ml, lấy vào mỗi cốc 10ml dung dịch mẫu đã chiết bằng lò vi sóng(4.3.)
5.2.3. Tiêp tục các bước 5.1.2 ... 5.1.6 như với dẫy tiêu chuẩn
5.2.4. Đo độ hấp thụ quang của dung dịch mẫu ở bước sống 410nm.
5.2.5. Đồng thời tiến hành mẫu trắng với 10ml nước, như với dung dịch mẫu.
5.2.6. Đo dung dich mẫu đồng nhất điều kiện với đo dung dịch tiêu chuẩn.
Căn cứ vào đồ thị tiêu chuẩn và số đo mẫu trên máy xác định nồng độ ppmNO3 trong dung dịch đo, từ đó suy ra hàm lượng NO3 trong mẫu
Công thức tính toán:
Trong đó:
a: hàm lượng NO3- trong thể tích trích (mg)
V: thể tích dung dịch mẫu sau khi chiết (ml)
v’: thể tích dung dịch trích ra để xác định (ml)
m: khối lượng mẫu tươi (g)
6.1.1. Xây dựng đường chuẩn NO2. Dẫy tiêu chuẩn 0 - 0,5ppm NO2- sử dụng thuốc thử Griss kiểu cũ.
6.1.2. Chuẩn bị một dẫy bình định mức 50ml, lần lượt thêm vào mỗi bình một lượng dung dịch nitrit tiêu chuẩn nồng độ 5ppm theo thứ tự ...0,0 ; 0,5 ; 1,0 ; 2,0 ; 3,0 ; 4,0 ; 5,0 ml.
6.1.3. Thêm vào mỗi bình 1ml thuốc thử Sunfanilic và 1ml thuốc thử ( naphtylamin.
6.1.4. Lên định mức bằng nước đến vạch và lắc kỹ.
Sau 20 phút đo độ hấp thụ quang của dung dịch ở bước sóng 520nm. Sau đó biểu diễn lên đồ thị ta được đường chuẩn có nồng độ NO2 trong dung dịch từ 0 - 0,5ppm NO2
(Có thể dùng thuốc thử Griss cải tiến: Mục 6.1.2 thay bằng thêm vào mỗi bình 1ml thuốc thử Sunfanylamit và 1ml thuốc thử N(1-naphtyl) etylen diamine dihydrroclorua (NED)
6.1.5. Đo mẫu:
6.1.6. Chuẩn bị một dẫy bình định mức 50ml, lần lượt thêm vào mỗi bình 10ml dung dịch mẫu
6.1.7. Thêm vào mỗi bình 1ml thuốc thử Sunfanilic và 1ml thuốc thử ( naphtylamin.
6.1.8. Lên định mức bằng nước cất đến vạch và lắc kỹ.
6.1.9. Sau 20 phút đo độ hấp thụ quang của dung dịch ở bước sóng 520nm.
6.1.10. Đồng thời tiến hành mẫu trắng với 10ml nước, tiến hành như với dung dịch mẫu.
6.1.11. Đo dung dich mẫu đồng nhất điều kiện với đo dung dịch tiêu chuẩn.
Căn cứ vào đồ thị tiêu chuẩn và số đo mẫu trên máy xác định nồng độ ppmNO2 trong dung dịch đo, từ đó suy ra hàm lượng NO2 trong mẫu
(Có thể dùng thuốc thử griss cải tiến: mục 6.2.2 thay bằng thêm vào mỗi bình 1ml thuốc thử sunfanylamit và 1ml thuốc thử n(1-naphtyl) etylen diamine dihydrroclorua (ned)
Công thức tính toán:
Trong đó:
a: hàm lượng NO3- trong thể tích trích (mg)
V: thể tích dung dịch mẫu sau khi chiết (ml)
v’: thể tích dung dịch trích ra để xác định (ml)
m: khối lượng mẫu tươi (g)
- 1 Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 451:2001 về phân tích cây trồng - Phương pháp xác định Nitơ tổng số do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành
- 2 Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 453:2001 về phân tích cây trồng - Phương pháp xác định Photpho tổng số do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành
- 3 Tiêu chuẩn ngành 10TCN 454:2001 về phân tích cây trồng - Phương pháp xác định Kali, Natri tổng số do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành
- 4 Tiêu chuẩn ngành 10TCN 455:2001 về phân tích cây trồng - Phương pháp xác định Canxi tổng số và Magiê tổng số do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành
- 5 Tiêu chuẩn ngành 10TCN 456:2001 về phân tích cây trồng - Phương pháp xác định lưu huỳnh tổng số do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành
- 6 Tiêu chuẩn ngành 10TCN 457:2001 về phân tích cây trồng - Phương pháp xác định sắt tổng số do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành
- 1 Quyết định 48/2001/QĐ-BNN-KHCN về tiêu chuẩn ngành do Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành
- 2 Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 451:2001 về phân tích cây trồng - Phương pháp xác định Nitơ tổng số do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành
- 3 Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 453:2001 về phân tích cây trồng - Phương pháp xác định Photpho tổng số do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành
- 4 Tiêu chuẩn ngành 10TCN 454:2001 về phân tích cây trồng - Phương pháp xác định Kali, Natri tổng số do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành
- 5 Tiêu chuẩn ngành 10TCN 455:2001 về phân tích cây trồng - Phương pháp xác định Canxi tổng số và Magiê tổng số do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành
- 6 Tiêu chuẩn ngành 10TCN 456:2001 về phân tích cây trồng - Phương pháp xác định lưu huỳnh tổng số do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành
- 7 Tiêu chuẩn ngành 10TCN 457:2001 về phân tích cây trồng - Phương pháp xác định sắt tổng số do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành
- 8 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8742:2011 về cây trồng - Xác định nitrat và nitrit bằng phương pháp so màu