Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12371-1:2019 về Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật - Phần 1: Yêu cầu chung quy định các nguyên tắc, phương pháp và quy trình kỹ thuật cơ bản nhằm phát hiện và định danh chính xác các tác nhân gây bệnh thực vật thuộc nhóm vi khuẩn, virus và phytoplasma. Tiêu chuẩn này đóng vai trò quan trọng trong công tác kiểm dịch thực vật, bảo vệ sản xuất nông nghiệp và ngăn ngừa sự lây lan của các dịch bệnh nguy hiểm xâm nhập vào Việt Nam.
Phạm vi áp dụng và đối tượng điều chỉnh
Tiêu chuẩn này áp dụng đối với các cơ quan quản lý nhà nước về bảo vệ và kiểm dịch thực vật, các phòng thử nghiệm, tổ chức, cá nhân thực hiện hoạt động giám định sinh vật hại thực vật tại Việt Nam. Phạm vi điều chỉnh của tiêu chuẩn tập trung vào các yêu cầu chung về trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất, quy trình thu thập, xử lý mẫu và các phương pháp giám định sinh học, sinh học phân tử đối với vi khuẩn, virus và phytoplasma gây bệnh.
Nội dung cốt lõi của Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12371-1:2019
1. Yêu cầu chung trong quy trình giám định (Phần 1)
- Quy định về điều kiện phòng thí nghiệm, trang thiết bị chuyên dụng và an toàn sinh học trong quá trình phân tích mẫu bệnh hại thực vật nhằm tránh lây nhiễm chéo.
- Hướng dẫn chi tiết về phương pháp thu mẫu, bảo quản mẫu và vận chuyển mẫu từ đồng ruộng về phòng thí nghiệm để đảm bảo tính nguyên vẹn của tác nhân gây bệnh.
- Các nguyên tắc chung trong việc lựa chọn phương pháp giám định phù hợp như nuôi cấy trên môi trường nhân tạo (đối với vi khuẩn), kiểm tra huyết thanh học (ELISA), hoặc các kỹ thuật sinh học phân tử (PCR, Real-time PCR) đối với virus và phytoplasma.
2. Yêu cầu cụ thể đối với Plum pox virus (Phần 2-1)
- Xác định các triệu chứng điển hình của bệnh do Plum pox virus gây ra trên các bộ phận của cây ký chủ, đặc biệt là nhóm cây ăn quả có hạt như mận, đào, mơ.
- Quy trình tách chiết RNA của virus từ các mẫu lá, vỏ cây hoặc quả nghi nhiễm bệnh.
- Áp dụng các kỹ thuật chẩn đoán đặc hiệu như RT-PCR hoặc ELISA để khẳng định sự hiện diện của Plum pox virus trong mẫu kiểm tra.
3. Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Xylella fastidiosa Wells et al. (Phần 2-2)
- Mô tả đặc điểm sinh học, triệu chứng gây hại của vi khuẩn Xylella fastidiosa trên các cây ký chủ quan trọng như nho, ô liu, cam quýt.
- Quy trình thu thập mẫu gỗ, cành hoặc cuống lá - nơi vi khuẩn thường cư trú trong mạch dẫn của cây.
- Phương pháp giám định bằng kỹ thuật PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu hoặc nuôi cấy trên môi trường chọn lọc để định danh chính xác loài vi khuẩn này.
4. Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al. (Phần 2-3)
- Hướng dẫn nhận biết triệu chứng héo rũ, loét thân và đốm quả do vi khuẩn Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis gây ra trên cây cà chua và các cây họ Cà khác.
- Quy trình phân lập vi khuẩn từ vết bệnh trên môi trường dinh dưỡng tiêu chuẩn và môi trường chọn lọc.
- Các thử nghiệm sinh hóa, sinh học phân tử và thử nghiệm khả năng gây bệnh trên cây chỉ thị để đưa ra kết luận giám định cuối cùng.
5. Quy trình xử lý mẫu mô cây nghi nhiễm bệnh
- Mẫu mô cây nghi nhiễm bệnh (bao gồm cành, thân, lá, rễ...) phải được rửa sạch dưới vòi nước chảy để loại bỏ hoàn toàn đất cát, bụi bẩn và các vi sinh vật bám dính bên ngoài trước khi tiến hành các bước phân tích tiếp theo.
- Sau khi rửa sạch, mẫu phải được để ráo nước tự nhiên hoặc lau khô bằng giấy thấm vô trùng, sau đó tiến hành cắt, nghiền hoặc tách chiết trong điều kiện vô trùng để tránh ngoại nhiễm.
Hiệu lực thi hành
Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12371-1:2019 có hiệu lực áp dụng kể từ ngày được cơ quan nhà nước có thẩm quyền công bố. Các phòng thử nghiệm và đơn vị kiểm dịch thực vật có trách nhiệm cập nhật, áp dụng đồng bộ các yêu cầu kỹ thuật nêu trên để nâng cao độ chính xác và tính pháp lý của kết quả giám định.
QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN, VIRUS, PHYTOPLASMA GÂY BỆNH THỰC VẬT
PHẦN 1: YÊU CẦU CHUNG
Procedure for identification of plant disease caused by bacteria, virus, phytoplasma
Part 1:General requirements
Lời nói đầu
TCVN 12371-1:2019 do Cục Bảo vệ thực vật biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
Bộ TCVN 12371 Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytolasma gây bệnh thực vật gồm các phần sau:
Phần 1: Yêu cầu chung
Phần 2-1 : Yêu cầu cụ thể đối với Plum pox virus
Phần 2-2 : Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Xylella fastidiosa Wells et al.
Phần 2-3 : Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al.
QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN, VIRUS, PHYTOPLASMA GÂY BỆNH THỰC VẬT
PHẦN 1: YÊU CẦU CHUNG
Procedure for identification of plant disease caused by bacteria, virus, phytoplasma
Part 1: General requirements
Tiêu chuẩn này quy định kĩ thuật chung trong quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật.
Tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các phiên bản sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 8597: 2010, Kiểm dịch thực vật - Phương pháp luận về việc lấy mẫu chuyến hàng
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và các thiết bị sau:
3.1 Túi lấy mẫu
3.2 Tủ lạnh: nhiệt độ từ 4 °C đến 8 °C
3.3 Giấy bản
3.4 Bìa các tông
3.5 Kẹp ép mẫu thực vật
3.6 Tủ lưu trữ mẫu: có khả năng duy trì nhiệt độ và ẩm độ thấp
3.7 Hộp lưu trữ mẫu
3.8 Lọ đựng mẫu: bằng vật liệu trơ với hóa chất, trong suốt, có nắp kín
3.9 Hộp chứa mẫu: Kín khí, có nắp đậy
3.10 Tủ lạnh sâu: nhiệt độ từ âm 80 °C đến âm 20 °C
3.11 Đèn cồn
3.12 Hộp petri
3.13 Que cấy thẳng, que cấy vòng
3.14 Pipette
3.15 Bản giếng ELISA
3.16 Túi ni-lông: vô trùng
3.17 Giấy thấm
3.18 Ống eppendorf
3.19 Bể ổn nhiệt
3.20 Chày, cối: sứ hoặc nhựa
3.21 Máy chu trình nhiệt (PCR)
3.22 Kính hiển vi: có độ phóng đại 40 lần đến 1 000 lần
Chỉ sử dụng các hóa chất loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác.
4.1 Silicagel
4.2 Nước cất
4.3 Glycerol (C3H8O3)
4.4 Cồn (C2H5OH): 70 % hoặc 90 %
4.5 Parafin
4.6 Dung dịch Natri hypoclorit (NaOCl) 10 %
4.7 Tím kết tinh (Crystal violet) 5 %
4.8 Dung dịch Lugol’s iodine
4.9 Dung dịch Safranin O 0,5 %
4.10 Dung dịch KOH 3 %
4.11 CTAB
4.12 Natri carbonat (Na2CO3)
4.13 Lab- Lemco Powder
4.14 Dung dịch axit sunfuric H2SO4 10 %
4.15 Đồng sunfat CuSO4
4.16 axit sunfuro H2SO3
4.17 Fomalin CH2O
4.18 2 mercaptoethanol HOCH2CH2SH
4.19 Chloroform: isoamyl alcohol (24:1)
4.20 Isopropanol C3H8O
4.21 TE
4.22 Agarose
4.23 Natri bicarbonate NaHCO3
4.24 Natri azua NaN3
4.25 Natri clorit NaCl
4.26 Natri hydro phosphate Na2HPO4
4.27 Kali biphosphate KH2PO4
4.28 Kali Clorua KCl
4.29 Tween-20
4.30 Magie Clorua MgCl2. 6H2O
4.31 Diethanolamine HN(CH2CH2OH)2
4.32 Yeast extract
4.33 Peptone
4.34 Agar
4.35 Kali hydro phosphate K2HPO4
4.36 Magie Suntat MgSO4. 7H2O
4.37 Bacteriological agar
4.38 Nước cất vô trùng
5.1 Lấy mẫu
5.1.1 Đối với cây trồng ngoài đồng ruộng
- Diện tích điều tra: phụ thuộc vào loại cây trồng, điều kiện cụ thể tại vùng điều tra và mục đích điều tra.
- Chọn điểm điều tra: Có thể chọn điểm điều tra theo một trong số các phương pháp sau
+ Chọn điểm theo đường chéo góc
+ Chọn điểm theo ô bàn cờ
+ Chọn điểm hình rẻ quạt
+ Chọn điểm ngẫu nhiên
+ Điều tra toàn bộ ruộng theo băng. Tại ruộng điều tra, điều tra toàn bộ ruộng theo phương pháp cuốn chiếu theo băng. Mỗi ruộng được chia ra làm các băng nhỏ, mỗi băng có chiều rộng 2 m, điều tra lần lượt từ đầu tới cuối băng và kiểm tra toàn bộ cây trồng trong mỗi băng điều tra.
- Số lượng mẫu: số lượng mẫu phụ thuộc vào mục đích điều tra và phương pháp lấy mẫu.
+ Cây ăn quả, cây lâu năm, cây công nghiệp: số lượng cây điều tra tại một điểm tối thiểu từ 3 cây đến 5 cây.
+ Cây hàng năm, rau màu, cây ngắn ngày: mỗi điểm có diện tích tối thiểu là 1 m2.
5.1.2 Đối với hàng hóa xuất, nhập khẩu, quá cảnh hoặc vận chuyển, bảo quản trong nước
Lấy mẫu theo TCVN 8597:2010.
5.2 Bảo quản mẫu
5.2.1 Mẫu nghi nhiễm vi khuẩn
5.2.1.1 Mẫu là các bộ phận tươi
Các bộ phận tươi nghi nhiễm vi khuẩn gây hại thực vật được chứa trong các túi lấy mẫu (3.1) bảo quản trong tủ lạnh (3.2) ở nhiệt độ từ 4 °C đến 5 °C.
Các mẫu tươi sau khi giám định hoặc gửi đi giám định có thể xử lý bằng các phương pháp sau.
Ép khô
Bộ phận nhiễm bệnh được ép khô bằng cách đặt giữa các lớp giấy bản (3.3) thường là từ 4 đến 5 tờ.
Các lớp giấy bản (3.3) (có chứa mẫu) được đặt giữa 2 miếng bìa các tông và đặt vào kẹp ép mẫu thực vật (3.5) sau đỏ nén chặt bằng dây hoặc vật nặng.
Trong quá trình làm khô mẫu giấy bản (3.3) nên thay thường xuyên khoảng 1 lần/ngày.
Kẹp ép mẫu thực vật (3.5) (có chứa mẫu) có thể phơi nắng, để trong phòng có điều hòa hoặc máy sưởi để tăng hiệu quả làm khô mẫu.
Thời gian làm khô mẫu hoàn toàn thông thường là từ 5 đến 10 ngày.
Mẫu đạt tiêu chuẩn là các mẫu không bị mốc, khô hoàn toàn, không bị gập gãy hoặc nhăn nheo.
Các mẫu vật sau khi ép khô được đặt trong các túi lấy mẫu (3.1) vô trùng, bên ngoài đề rõ các thông tin liên quan như: ngày, tháng lấy mẫu, thông tin kí chủ, thông tin bệnh hại (hoặc nghi ngờ loại bệnh hại), địa điểm (hoặc lô hàng lấy mẫu).
Các túi lấy mẫu (3.1) bằng giấy được lưu trữ trong các tủ lưu trữ mẫu (3.6) (hoặc các hộp lưu trữ mẫu (3.7)) có độ ẩm thấp (có thể sử dụng các vật liệu chống ẩm như Silicagel (4.1)...)
Ngâm mẫu
Bộ phận nhiễm bệnh được rửa nhẹ dưới vòi nước chảy sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng (4.38).
Mẫu được để chỗ thoáng để bề mặt khô hoàn toàn.
Có thể ngâm mẫu vào dung dịch H2SO410 % (4.14) bổ sung thêm từ 2 đến 3 giọt glycerol (4.3) và từ 2 đến 3 giọt cồn 90 % (4.4) trong vòng 24 giờ.
Vớt mẫu vật ra, rửa trong nước lạnh.
Chuyển mẫu vào lọ đựng mẫu có chứa dung dịch bảo quản (Xem phụ lục C) và đậy chặt nắp.
Thay dung dịch bảo quản khi thấy hiện tượng dung dịch bị vẩn đục (hoặc 6 tháng 1 lần) cho đến khi dung dịch bảo quản không bị vẩn đục nữa thì gắn chặt lọ mẫu bằng parafin (4.5).
Dán nhãn bên ngoài lọ đựng mẫu ghi rõ các thông tin liên quan như: ngày, tháng lấy mẫu; thông tin kí chủ; thông tin bệnh hại (hoặc nghi ngờ loại bệnh hại); địa điểm (hoặc lô hàng lấy mẫu).
5.2.1.2 Mẫu là các sản phẩm khô
Mau được để trong các túi chứa mẫu (3.1) hoặc hộp chứa mẫu (3.9) kín có nhãn và bảo quản ở nhiệt độ phòng.
5.2.2 Mẫu nghi nhiễm virus, phytoplasma
5.2.2.1 Mẫu là các bộ phận tươi
Các bộ phận tươi được chứa trong các túi chứa mẫu bảo quản trong tủ lạnh sâu (3.10) ở nhiệt độ âm 80 °C.
Các mẫu tươi sau khi giám định hoặc mẫu gửi đi giám định có thể làm mẫu khô để bảo quản theo phương pháp sau:
Làm mẫu khô
- Bộ phận nhiễm bệnh (lá hoặc cành) được đặt trong túi chứa mẫu có chứa Silicagel (4.1). (Chú ý thay Silicagel (4.1) mới khi phần cũ đã hút ẩm tối đa)
- Mẫu đạt tiêu chuẩn là các mẫu không bị mốc, khô hoàn toàn, không bị gập gãy hoặc nhăn nheo.
- Các mẫu vật sau khi ép khô được đặt trong các túi chứa mẫu bằng giấy bên ngoài đề rõ các thông tin liên quan như: ngày, tháng lấy mẫu; thông tin kí chủ; thông tin bệnh hại (hoặc nghi ngờ loại bệnh hại); địa điểm (hoặc lô hàng lấy mẫu).
- Các túi lấy mẫu (3.1) bằng giấy được lưu trữ trong các tủ lưu trữ mẫu (3.6) (hoặc các hộp (3.7)) có độ ẩm thấp (có thể sử dụng các vật liệu chống ẩm như silicagel (4.1)...)
5.2.2.2 Mẫu là các sản phẩm khô
Mẫu được để trong các túi chứa mẫu (3.1) hoặc hộp chứa mẫu (3.9) kín có nhãn và bảo quản ở nhiệt độ phòng.
Phát hiện và thu thập mẫu bệnh dựa vào một số đặc tính sinh học quan trọng của loài dịch hại là phân bố, ký chủ và triệu chứng hại,
- Phân bổ: Mỗi loài vi khuẩn hoặc virus hoặc phytoplasma chỉ có khả năng tồn tại và gây hại tại vùng có điều kiện khí hậu phù hợp cho sinh trưởng, phát triển của loài đó.
- Ký chủ: Mỗi loài vi khuẩn hoặc virus hoặc phytoplasma có khả năng gây hại cho một phổ ký chủ.
- Triệu chứng bệnh: Triệu chứng do vi khuẩn hoặc virus hoặc phytoplasma gây hại trên thực vật thường rất đặc trưng và khác nhau tùy thuộc vào loài vi khuẩn hoặc virus hoặc phytoplasma, loài ký chủ, bộ phận bị hại và giai đoạn hại.
7.1 Giám định vi khuẩn gây bệnh thực vật
Có thể áp dụng một hoặc một số các phương pháp sau tùy thuộc vào từng loài vi khuẩn cụ thể.
7.1.1 Giám định bằng phương pháp hình thái kết hợp với phản ứng sinh hóa
7.1.1.1 Phân lập và nuôi cấy làm thuần trên môi trường nhân tạo
Bước 1: Khử trùng bề mặt mẫu bệnh
Phần mô cây nghi nhiễm bệnh (cành, thân, lá...) được rửa sạch dưới vòi nước chảy
Khử trùng bề mặt bằng cách ngâm mẫu trong dung dịch Natri hypoclorit 10 % (4.6) trong 2 phút hoặc cồn 70 % (4.4) từ 30 giây đến 60 giây sau đó rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng (4.38). Với các mô gỗ khử trùng bằng cách nhúng cồn 70 % (4.4) và hơ qua ngọn lửa đèn cồn (3.11).
Bước 2: Tách chiết vi khuẩn
Có thể tách chiết vi khuẩn từ mô cây, hạt nghi bị bệnh bằng một hoặc một số biện pháp:
- Ngâm mẫu trong nước cất vô trùng (4.38).
- Nghiền mẫu trong nước cất vô trùng (4.38) hoặc trong dịch chiết.
Bước 3: Phân lập
Trang đều dịch chiết trên môi trường đặc hiệu (Xem phụ lục B). Đặt các đĩa petri (3.12) ở nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển.
Bước 4: Nuôi cấy làm thuần
Chọn các khuẩn lạc có hình thái phù hợp với mô tả hình thái của khuẩn lạc vi khuẩn nghi ngờ gây bệnh cấy truyền trên môi trường đặc hiệu.
7.1.1.2 Phản ứng nhuộm Gram
Có thể dùng một trong hai phương pháp sau:
Phương pháp 1
Bước 1: Dùng que cấy vô trùng lấy một ít khuẩn lạc từ bước 4 điều 7.1.1.1 hoà vào 1 giọt nước cất (4.2) ở giữa lam kính, làm khô trong không khí. Thông thường các khuẩn lạc sẽ được lấy sau khi cấy 24 giờ.
Bước 2: Cố định tế bào bằng cách hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2 đến 3 lần.
Bước 3: Nhuộm bằng dung dịch Tím kết tinh (Crystal violet) 0,5 % (4.7) trong 30 giây, rửa nước, thấm khô.
Bước 4: Nhuộm lại bằng dung dịch Lugol's iodine (4.8) trong 30 giây, rửa nước, thấm khô.
Bước 5: Nhỏ cồn 70 % (4.4), giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô.
Bước 6: Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin O 0,5 % (4.9) trong 1 đến 2 phút, rửa nước, để khô trong không khí.
Bước 7: Quan sát dưới kính hiển vi (4.21) ở vật kính có độ phóng đại 1 000 lần
Đọc kết quả: Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím
Vi khuẩn Gram (-) bắt màu đỏ.
Phương pháp 2
Bước 1: Dùng pipette (3.14) nhỏ 1 giọt KOH 3 % (4.10) lên một lam kính sạch.
Bước 2: Sử dụng que cấy vòng (3.13) lấy một ít khuẩn từ môi trường (xem 7.2) nuôi cấy trộn đều với dung dịch KOH 3 % (4.10) tới khi tạo huyền phù.
Bước 3: Nhấc que cấy lên khỏi giọt dịch một khoảng 5 mm đến 20mm
Đọc kết quả: Vi khuẩn Gram (-) nếu có một đám nhầy (dạng sợi) được kéo theo que cấy
Vi khuẩn Gram (+) nếu không có đám nhầy (dạng sợi) được kéo theo que cấy.
CHÚ THÍCH: Đây là phản ứng sinh hóa cơ bản và chung nhất trong giám định vi khuẩn bằng phản ứng sinh hóa. Tùy loài vi khuẩn mà bộ phản ứng sinh hóa để giám định sẽ khác nhau. Bộ phản ứng sinh hóa của từng loài vi khuẩn cụ thể sẽ được nêu trong từng tiêu chuẩn cụ thể dành riêng cho loài.
7.1.2 Giám định bằng ELISA
7.1.2.1 Phân lập và nuôi cấy làm thuần trên môi trường nhân tạo
Thực hiện theo điều 7.1.1.1
7.1.2.2 Chuẩn bị dịch mẫu
Có thể chuẩn bị dịch mẫu từ mô bệnh hoặc từ khuẩn lạc đã được nuôi cấy làm thuần vi khuẩn.
- Mẫu mô cây (quả, thân, lá): lấy một mẫu nhỏ mô cây (quả hoặc thân hoặc lá) ngâm trong 1 ml nước cất (4.2) khoảng 15 phút đến 20 phút. Sau đó nước chứa vi khuẩn được ly tâm 13 000 vòng/phút trong 5 phút thu kết tủa vi khuẩn. Hoà tan kết tủa vi khuẩn thu được trong 1ml dung dịch đệm chiết mẫu (xem phụ lục A).
- Khuẩn lạc đã được nuôi cấy làm thuần vi khuẩn: Hoà tan một phần khuẩn lạc (xem 7.1.2.1) trong 1ml dung dịch đệm chiết mẫu (xem phụ lục A).
7.1.2.3 Quy trình thực hiện ELISA
Có thể sử dụng kít ELISA thương mại hoặc làm theo phương pháp sau:
Bước 1: Nhỏ vào mỗi giếng ELISA (3.15) 100 µl dịch mẫu.
Bước 2: Bọc bản giếng bằng túi ni-lông (3.16) ủ ở 37 °C qua đêm (khoảng 4 đến 6 giờ).
Bước 3: Sau đó, nhỏ thêm vào mỗi giếng 200 µl dung dịch đệm cố định mẫu (xem phụ lục A).
Bước 4: Bọc bản giếng bằng túi ni-lông (3.16) ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng.
Bước 5: Rửa giếng bằng đệm rửa (xem phụ lục A) ba lần sau đó loại sạch đệm rửa bằng cách vỗ nhẹ bản giếng trên giấy thấm.
Bước 6: Thêm vào mỗi giếng 100 µl kháng thể.
Bước 7: Bọc bản giếng bằng túi ni-lông (3.16) ủ 1 giờ ở nhiệt độ phòng.
Bước 8: Rửa giếng bằng đệm rửa tám lần sau đó loại sạch đệm rửa bằng cách vỗ nhẹ bản giếng trên giấy thẩm.
Bước 9: Thêm vào mỗi giếng 100 µl Enzym gắn.
Bước 10: Bọc bản giếng bằng túi ni-lông (3.16) ủ 1 giờ ở nhiệt độ phòng.
Bước 11: Rửa giếng bằng đệm rửa tám lần sau đó loại sạch đệm rửa bằng cách vỗ nhẹ bản giếng trên giấy thấm.
Bước 12: Thêm vào mỗi giếng 100 µl đệm cơ chất (xem phụ lục A). Ủ 1 giờ ở nhiệt độ phòng.
7.1.2.4 Đọc kết quả
Đọc kết quả bằng mắt thường hoặc bằng máy đọc ở bước sóng 405 nm.
7.1.3 Giám định bằng PCR
7.1.3.1 Phân lập và nuôi cấy làm thuần trên môi trường nhân tạo
Thực hiện theo điều 7.1.1.1
7.1.3.2 Tách chiết DNA
Có thể tách chiết DNA từ mô bệnh hoặc từ khuẩn lạc đã được nuôi cấy làm thuần vi khuẩn.
- Khuẩn lạc đã được nuôi cấy làm thuần vi khuẩn: Dùng que cấy vi khuẩn (3.13) lấy một khuẩn lạc trên môi trường (xem 7.1.1) cho vào ống eppendof (3.18) đã chứa 100µl nước cất vô trùng khuấy (4.38) đều để hoà tan khuẩn lạc. Tiếp theo để ống eppendof (3.18) ở nhiệt độ 95 °C trong 15 phút trong bể ổn nhiệt (3.19) sau đó đặt ngay lên đá lạnh. Ly tâm dịch vi khuẩn trong 5 đến 10 giây.
- Mẫu mô cây (quả, thân, lá): Cho 100 µl dịch chiết vi khuẩn (xem bước 2 điều 7.1.1) vào ống eppendof (3.18) và để ở nhiệt độ 95 °C trong 15 phút trong bể ổn nhiệt (3.11) sau đó đặt ngay lên đá lạnh. Tiếp theo, ly tâm dịch chiết trong 5 đến 10 giây.
- Tách chiết bằng CTAB (với mô cây nghi nhiễm bệnh)
Bước 1: Nghiền nhỏ từ 0,5 g đến 1 g mô cây nghi nhiễm bệnh bằng cối và chày sứ (3.20) trong 5ml CTAB (4.11) có chứa 2 % 2 mercaptoethanol (4.18)
Bước 2: Lấy 1 ml dịch nghiền vào ống eppendof (3.18)
Bước 3: Ủ ở 65 °C trong 30 phút.
Bước 4: Ly tâm 10 phút tốc độ 12 000 vòng/phút.
Bước 5: Thu dịch phía trên sang ống eppendof (3.18) mới đo lượng dịch
Bước 6: Thêm vào ống eppendof (3.18) lượng dịch chloroform (CHCl3):isoamyl alcohol (24:1) (4.19) bằng lượng dịch thu được ở bước 4, lắc đều
Bước 7: Ly tâm 10 phút tốc độ 12 000 vòng/phút.
Bước 8: Thu dịch phía trên sang ống eppendof (3.18) mới, đo lượng dịch
Bước 9: Thêm vào ống lượng dịch isopropanol (4.20) bằng 0,7 dịch thu được ở bước 8. Lắc nhẹ, để tủa trong vòng 20 phút (nhiệt độ âm 20 °C)
Bước 10: Ly tâm tốc độ 12 000 vòng/phút trong 20 phút, loại bỏ phần dịch phía trên
Bước 11: Rửa kết tủa DNA 2 lần bằng cồn 70 % (4.4)
Bước 12: Hòa tan kết tủa DNA bằng TE (4.21), pH 8.0
7.1.3.3 Nhân gen
RNA thu được tiến hành nhân gen trong máy chu trình nhiệt (PCR) (3.21)
Sử dụng đoạn mồi đặc hiệu.
7.1.3.4 Đọc kết quả
Sản phẩm được điện di bằng gel agarose(4.21).
Mẫu dương tính cho đoạn gen kích thước như hướng dẫn.
7.2 Giám định virus, phytoplasma bằng phương pháp RT-PCR
7.2.1 Tách chiết RNA
Có nhiều phương pháp tách chiết RNA khác nhau, tùy vào điều kiện của phòng thí nghiệm có thể áp dụng cách tách chiết khác nhau. Sau đây là một số cách tách chiết phổ biến có thể áp dụng.
- Tách chiết bằng CTAB (với mô cây nghi nhiễm bệnh)
Bước 1: Nghiền nhỏ 200 mg mô cây nghi nhiễm bệnh bằng cối và chày
Bước 2: Chuyển phần mô đã nghiền vào ống eppendof (3.18) thêm vào 500 µl dịch chiết CTAB (4.11) bổ sung 2 % 2 mercaptoethanol (4.18).
Bước 3: Ủ ở 65 °C trong 30 phút.
Bước 4: Ly tâm 10 phút tốc độ 12000 vòng/phút.
Bước 5: Thu dịch phía trên sang ống eppendof (3.18) mới đo lượng dịch
Bước 6: Thêm vào ống lượng dịch chloroform: isoamyl alcohol(24:1) (4.19) gấp đôi lượng dịch thu được ở bước 4, lắc đều
Bước 7: Ly tâm 10 phút tốc độ 12 000 vòng/phút.
Bước 8: Thu dịch phía trên sang ống eppendof (3.18) mới, đo lượng dịch
Bước 9: Thêm vào ống lượng dịch isopropanol (4.20) bằng 2/3 dịch thu được ở bước 8. Lắc nhẹ để tủa trong vòng 1 giờ (nhiệt độ âm 20 °C)
Bước 10: Ly tâm tốc độ 12 000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ phần dịch phía trên
Bước 11: Rửa tủa 2 lần bằng cồn 70 % (4.4)
Bước 12: Hòa tan tủa bằng TE (4.21), pH 8.0
- Tách bằng kít (ví dụ cụ thể của hãng QIAGEN)
Bước 1: Thêm 10 µl 2-mercaptoethanol vào 1 ml dịch chiết RLT
Bước 2: Thêm 450 µl dịch chiết ở bước 1 vào 0,1 g mẫu tươi hoặc 0,02 g mẫu đông lạnh
Bước 3: nghiền nhỏ mẫu
Bước 4: Chuyển dịch nghiền mẫu vào ống ly tâm màu tím (được đặt trong ống ly tâm 2 ml)
Bước 5: Ly tâm ở 13 000 vòng/phút trong 2 phút
Bước 6: Chuyển dịch phía dưới ống sang ống mới (không lấy phần cặn ly tâm)
Bước 7: Chuyển phần dịch thu được ở bước 6 sang cột ly tâm màu hồng (đặt trong ống ly tâm 2ml)
Bước 8: Ly tâm ở 10 000 vòng/phút trong 15 giây Bước 9: Loại bỏ dịch ở ống 2 ml
Bước 10: Thêm vào cột ly tâm màu hồng 700 µl đệm RW1
Bước 11: Ly tâm ở 10 000 vòng/phút trong 15 giây
Bước 12: Loại bỏ dịch ở ống 2 ml
Bước 13: Ly tâm ở 10 000 vòng/phút trong 2 phút
Bước 14: Đặt cột ly tâm màu hồng vào ống ly tâm 1,5 ml mới
Bước 15: Thêm 30 µl Rnase-free water vào cột ly tâm màu hồng
Bước 13: Ly tâm ở 10 000 vòng/phút trong 1 phút
7.2.2 Nhân gen
Nhân gen trong máy chu trình nhiệt PCR (3.21).
Sử dụng đoạn mồi đặc hiệu.
Chu trình nhiệt được thiết kế dựa theo trình tự mồi
7.2.3 Đọc kết quả
Sản phẩm được điện di bằng gel agarose (4.21)
Mẫu dương tính cho đoạn gen kích thước như hướng dẫn.
Nội dung phiếu kết quả giám định gồm những thông tin cơ bản sau:
- Thông tin về mẫu giám định.
- Tên loài
- Phương pháp giám định
- Người giám định/cơ quan giám định
Chuẩn bị và điều chế môi trường nhân tạo
B.1 Hấp, sấy khử trùng
B.1.1 Sấy khử trùng
Dùng phương pháp này để khử trùng hộp lồng và dụng cụ thủy tinh. Dụng cụ phải được rửa sạch và gói riêng rẽ bằng giấy nhôm rồi đặt vào hộp bằng chất liệu phù hợp để có thể sấy được. Tránh không nên sử dụng giấy để gói vì sẽ làm dính kết vào dụng cụ và có thể gây cháy trong quá trình sấy. Dụng cụ thủy tinh có thể được sấy trong tủ sấy bằng không khí nóng, các đồ sấy không nên xếp quá chật để đảm bảo không khí nóng đối lưu, khí nóng phải đảm bảo tiếp xúc đều tất cả các phần của dụng cụ để quá trình sấy đạt hiệu quả tốt.
Có thể sử dụng các nhiệt độ và cách sấy sau:
| Nhiệt độ | Thời gian |
| 120 °C | 8 giờ |
| 140 °C | 3 giờ |
| 160 °C | 1 giờ |
| 180 °C | 20 phút |
B.1.2 Hấp khử trùng bằng nồi hấp
Dùng phương pháp này để khử trùng môi trường nhân tạo. Các nồi hấp vô trùng tự động (autoclave) hoặc các nồi áp suất đều có thể sử dụng để hấp vô trùng. Các môi trường nhân tạo sau khi điều chế được đựng trong các bình thủy tinh có nắp. Các bình này được đặt trong các lồng, hộp của nồi hấp vô trùng và đặt vào nồi hấp. Không nên để nghiêng hay rót môi trường quá đầy tránh làm trào môi trường trong quá trình khử trùng. Không nên xếp chồng chéo hoặc quá đầy ảnh hưởng tới luồng không khí đối lưu trong nồi hấp. Hấp khử trùng thường ở nhiệt độ 121 °C trong thời gian 30 phút.
Khi vận hành nồi hấp vô trùng kiểu mới (autoclave) hay kiểu cũ đều cần sự giám sát cẩn thận và tuân thủ hướng dẫn sử dụng máy.
B.2 Điều chế môi trường nhân tạo
B.2.1 Môi trường Nutrient agar
Thành phần
| Lab- Lemco Powder (4.13) | 1 g |
| Yeast extract (4.32) | 2 g |
| Peptone (4.33) | 5 g |
| NaCl (4.25) | 5g |
| Agar (4.34) | 15g |
| Nước cất (4.2) | 1 000 ml |
Phương pháp điều chế:
Hòa tan các thành phần trên theo thứ tự vào nước cất, chỉnh pH 7,2 đến 7,4.
Hấp khử trùng (xem B.1.2).
B.2.2 Môi trường King’ B
Thành phần
| Peptone (4.33) | 20 g |
| Glycerol (4.3) | 10 ml |
| K2HPO4 (4.13) | 1,5 g |
| MgSO4. 7 H2O (4.36) | 1,5 g |
| Bacteriological agar (4.37) | 15 g |
| Nước cất (4.2) | 1 000 ml |
Phương pháp điều chế:
Hòa tan các thành phần trên theo thứ tự vào nước cất chỉnh pH tới 7,2 ± 0,2
Hấp khử trùng (xem B.1.2).
CHÚ THÍCH: Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều loại môi trường nhân tạo để nuôi vi khuẩn có thể mua các loại môi trường này sau đó điều chế theo hướng dẫn của nhà sản xuất hoặc tự điều chế theo phương pháp nêu trên.
Có thể sử dụng một trong những dung dịch bảo quản sau:
| Dung dịch 1: | ||
|
| CuSO4 (4.15) | 85 g |
|
| H2SO3 (4.16) | 28,4 ml |
|
| Nước (4.2) | 2 485 ml |
| Dung dịch 2: | ||
|
| H2SO3 (4.16) | 284 ml |
|
| Nước (4.2) | 3 785 ml |
| Dung dịch 2: | ||
|
| Muối bão hòa | 1 000 ml |
|
| Fomalin (4.17) | 500 ml |
|
| Nước (4.2) | 870 ml |
| Dung dịch 3: | ||
|
| Fomalin (4.17) | 450 ml |
|
| Cồn 70 % (4.4) | 540 ml |
|
| Nước (4.2) | 1 810 ml |
Cách pha dung dịch muối bão hòa:
Hòa tan muối trong nước nóng đến mức độ bão hòa.
Để dung dịch nguội trong 3 giờ.
Lọc bỏ phần không tan hết
[1] Bradbury J. F,1986. Guide to Plant Pathogenic Bacteria, C.A.B International, United Kingdom.
[2] Commonwealth Mycologycal Institute, (1983), Plant Pathologist's Pocketbook.
[3] IPPC, (2006), ISPM 27 Diagnostic protocols for regulated pests.
[4] Viện Bảo vệ thực vật, (1997), Tập 1: Phương pháp điều tra cơ bản dịch hại nông nghiệp và thiên địch của chúng, Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật, NXB Nông nghiệp.
[5] QCVN 01-175:2014. Lưu giữ, bảo quản và vận chuyển mẫu trong kiểm dịch thực vật
- 1 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8597:2010 về kiểm dịch thực vật - phương pháp luận về việc lấy mẫu chuyến hàng
- 2 Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-175:2014/BNNPTNT về Quy trình lưu trữ, bảo quản và vận chuyển mẫu trong kiểm dịch thực vật
- 3 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12371-2-2:2018 về Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật - Phần 2-2: Yêu cầu cụ thể đối với khuẩn Xylella fastidiosa Wells et al.
- 4 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12371-2-1:2018 về Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật - Phần 2-1: Yêu cầu cụ thể đối với virus Plum pox virus
- 5 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12371-2-3:2019 về Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật - Phần 2-3: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al.
- 1 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12561:2018 về Thuốc bảo vệ thực vật - Khảo nghiệm hiệu lực sinh học của thuốc trên đồng ruộng
- 2 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12562:2018 về Thuốc bảo vệ thực vật - Khảo nghiệm thời gian cách ly của thuốc trên cây trồng
- 3 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12195-2-6:2018 về Quy trình giám định nấm gây bệnh thực vật - Phần 2-6: Yêu cầu cụ thể đối với Phytophthora boehmeriae Sawada
- 1 Quyết định 4121/QĐ-BKHCN năm 2019 công bố Tiêu chuẩn quốc gia về Quy trình giám định nấm gây bệnh thực vật và giám định côn trùng, thuốc bảo vệ thực vật do Bộ trưởng Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành
- 2 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8597:2010 về kiểm dịch thực vật - phương pháp luận về việc lấy mẫu chuyến hàng
- 3 Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-175:2014/BNNPTNT về Quy trình lưu trữ, bảo quản và vận chuyển mẫu trong kiểm dịch thực vật
- 4 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12561:2018 về Thuốc bảo vệ thực vật - Khảo nghiệm hiệu lực sinh học của thuốc trên đồng ruộng
- 5 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12562:2018 về Thuốc bảo vệ thực vật - Khảo nghiệm thời gian cách ly của thuốc trên cây trồng
- 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12195-2-6:2018 về Quy trình giám định nấm gây bệnh thực vật - Phần 2-6: Yêu cầu cụ thể đối với Phytophthora boehmeriae Sawada
- 7 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12371-2-2:2018 về Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật - Phần 2-2: Yêu cầu cụ thể đối với khuẩn Xylella fastidiosa Wells et al.
- 8 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12371-2-1:2018 về Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật - Phần 2-1: Yêu cầu cụ thể đối với virus Plum pox virus
- 9 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12371-2-3:2019 về Quy trình giám định vi khuẩn, virus, phytoplasma gây bệnh thực vật - Phần 2-3: Yêu cầu cụ thể đối với vi khuẩn Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis et al.