TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12372-1:2019

QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH CỎ DẠI GÂY HẠI THỰC VẬT
PHẦN 1: YÊU CẦU CHUNG

Procedure for identification of weeds
Part 1: General requirements

Lời nói đầu

TCVN 12372-1:2019 do Cục Bảo vệ thực vật biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ TCVN 12372 Quy trình giám định cỏ dại gây hại thực vật gồm các phần sau đây:

- TCVN 12372-1:2019, Phần 1: Yêu cầu chung

- TCVN12372-2:2018, Phần 2-1: Quy định cụ thể đối với tơ hồng Cuscuta australis R. Br. và Cuscuta chinensis Lam.

QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH CỎ DẠI GÂY HẠI THỰC VẬT
PHẦN 1: YÊU CẦU CHUNG

Procedure for identification of weeds
Part 1: General requirements

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định yêu cầu chung đối với quy trình giám định cỏ dại gây hại thực vật.

2  Tài liệu viện dẫn

Tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 8597: 2010, Kiểm dịch thực vật - Phương pháp luận về việc lấy mẫu chuyển hàng.

3  Thuật ngữ và định nghĩa

Tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ, định nghĩa sau.

3.1

Cỏ dại gây hại thực vật (weeds)

Những thực vật mọc lẫn với cây trồng, ngoài ý muốn của con người, tranh chấp nước, ánh sáng và các chất dinh dưỡng của cây trồng, ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển của cây, làm xấu đất, tăng chi phí sản xuất. Ngoài ra cỏ dại còn là ký chủ của nhiều côn trùng và bệnh gây hại cho cây trồng.

3.2

Thực vật ký sinh (parasitic plants)

Những thực vật sống phụ thuộc một phần hoặc hoàn toàn vào những thực vật khác.

3.3

Thực vật bán ký sinh (semi- parasitic plants)

Những thực vật chỉ sống ký sinh một phần, có quá trình quang hợp và có khả năng tự tổng hợp chất diệp lục.

3.4

Ký chủ (hosts)

Những thực vật và sản phẩm thực vật là thức ăn không thể thiếu để sinh sống, phát triển của sinh vật gây hại.

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm và các thiết bị sau:

4.1  Kính lúp soi nổi: độ phóng đại từ 6,5 lần đến 50 lần

4.2  Cân kỹ thuật: cân được khối lượng từ 0,1 g đến 1 000 g với độ chính xác 0,1 g ± 0,01 g

4.3  Tủ sấy: nhiệt độ tối đa 200 °C.

4.4  Bộ sàng sàng lọc hạt cỏ: gồm các ngăn sàng với đường kính các mắt sàng là 0,5 mm, 1 mm, 1,5 mm, 2 mm.

4.5  Đũa thủy tinh

4.6  Lam kính

4.7  Tôn sóng: kích thước 42 cm x 30 cm.

4.8  Khay men: kích thước 30 cm x 40 cm; 20 cm x 30 cm.

4.9  Túi đựng mẫu: túi ni lông có quai đựng được khối lượng 5 kg, 10 kg; túi zip kích thước 7 cm x 12 cm,...

4.10  Dao, kéo

4.11  Lọ nút mài: thể tích 60 ml, 250 ml

4.12  Túi nhỏ/ phong bì nhỏ bằng giấy không axit

4.13  Lọ ngâm mẫu: lọ thủy tình hình trụ, kích thước 10 cm x 20 cm

4.14  Bìa các tông cứng kích thước 42 cm x 30 cm; kim, chỉ để khâu mẫu: là dạng chỉ có sợi bông pha nilon; giấy bản; băng dính giấy; bìa bọc (dạng bìa mỏng, dai được gập đôi lại, bọc mẫu thực vật đã cố định trên bìa cứng, kích thước 44 cm x 32 cm)

4.15  Khung gỗ ép mẫu: khung bằng gỗ, kích thước 42 cm x 30 cm

4.16  Phễu lọc

4. 17  Bay, thuôn để lấy mẫu đất

4.18  Ống đong: thể tích 50 ml, 100 ml, 500 ml

4.19  Pipet: thể tích 5 ml, 10 ml

4.20  Máy ảnh kỹ thuật số: độ phân giải tối thiểu là 20 megapixel (20 MP)

4.21  Tủ lạnh sâu: nhiệt độ đến âm 20 °C (- 20 °C)

4.22  Tủ định ôn

5  Hóa chất

Chỉ sử dụng các hóa chất loại tinh khiết, trừ khi có quy định khác

5.1  Đồng sunfat (CuSO₄): khan

5.2  Axit sunfuric (H₂SO₄): nồng độ 98%

5.3  Natri sunfat (Na₂SO₄): khan

5.4  Axit sunfurơ (H²SO₃): nồng độ 98%

5.5  Cồn (C₂H₅OH): nồng độ 60 %

5.6  Parafin

5.7  Nước cất

5.8  Dung dịch đồng sunfat (CuSO₄): nồng độ 10 %

5.9  Cồn (C₂H₅OH): nồng độ 50 %

5.10  Silicagen

6  Lấy mẫu và bảo quản mẫu

6.1  Lấy mẫu

6.1.1  Đối với hàng hóa xuất, nhập khẩu, quá cảnh hoặc vận chuyển, bảo quản trong nước

Lấy mẫu theo TCVN 8597: 2010.

Mẫu thu được được đựng trong các túi đựng mẫu (4.9) có ghi nhãn đầy đủ.

6.1.2  Đối với cây trồng ngoài đồng ruộng

6.1.2.1  Lấy mẫu cây cỏ

6.1.2.1.1  Đối với cỏ dại gây hại thực vật là các loài ký sinh và bán ký sinh

Quan sát phát hiện, thu tất cả mẫu cỏ dại trên các thực vật là ký chủ của chủng tại các điểm điều tra.

Mẫu cần được kèm theo lý lịch mẫu gồm bản mô tả mẫu (hay sổ thực địa) và nhãn mẫu gắn trên các mẫu. Bản mô tả mẫu cần có đủ các thông tin chủ yếu sau: Số hiệu mẫu (ghi tại thực địa), tên mẫu, tên người thu mẫu, địa điểm và thời gian thu mẫu, điều kiện tự nhiên nơi thu mẫu, đặc điểm của loài được thu mẫu (màu sắc thân, hoa, quả; thời gian ra hoa, quả,...), ký chủ (tên, đặc điểm...). Nhãn mẫu thể hiện các thông tin gồm: Số hiệu mẫu, địa điểm và thời gian thu mẫu, người thu mẫu.

Dùng máy ảnh (4.20) chụp ảnh nơi sống, dạng cây, đoạn thân mang hoa, quả ...

6.1.2.1.2  Đối với cỏ dại gây hại thực vật là các loài cỏ cạnh tranh

Quan sát phát hiện, thu tất cả mẫu cỏ dại tại các điểm điều tra theo 5 điểm chéo góc hoặc 5 điểm ngẫu nhiên hoàn toàn.

Mẫu cần được kèm theo lý lịch mẫu gồm bản mô tả mẫu (hay sổ thực địa) và nhãn mẫu gắn trên các mẫu. Bản mô tả mẫu cần có đủ các thông tin chủ yếu sau: số hiệu mẫu (ghi tại thực địa), tên mẫu, tên người thu mẫu, địa điểm và thời gian thu mẫu, điều kiện tự nhiên nơi thu mẫu, đặc điểm của loài được thu mẫu (màu sắc thân, hoa, quả; thời gian ra hoa, quả,...). Nhãn mẫu thể hiện các thông tin gồm: Số hiệu mẫu, địa điểm và thời gian thu mẫu, người thu mẫu.

Dùng máy ảnh (4.20) chụp ảnh nơi sống, dạng cây, đoạn thân mang hoa, quả ...

6.1.2.2  Lấy mẫu hạt cỏ trong đất

6.1.2.2.1  Đối với cỏ dại gây hại thực vật là các loài ký sinh và bán ký sinh

Tại gốc của những cây ký chủ phát hiện thấy cỏ dại ký sinh: lấy mẫu tại 5 điểm chéo góc trong phạm vi tán cây. Dùng bay, thuôn (4.17) lấy đất ở lớp đất mặt có độ sâu từ 0 cm đến 20 cm, kích thước bề mặt mẫu là 15 cm x 15 cm sao cho trọng lượng mẫu đất đạt tối thiểu là 200 g, mẫu đất được đựng trong các túi đựng mẫu (4.9).

Mẫu đất được phơi hoặc sấy khô, sau đó làm tơi đất, để lên khay (4.8), chia đều để lấy 1 phần mẫu khối lượng 200 g, đựng mẫu trong túi đựng mẫu. Dùng sàng (4.4), kích thước mắt sàng lớn hơn 1 mm để sàng tách hạt cỏ ra khỏi đất hoặc có thể hòa mẫu đất vào nước, dùng phễu (4.16) có lót vải thưa để lọc mẫu thu hạt cỏ dại.

6.1.2.2.2  Đối với cỏ dại gây hại thực vật là các loài cỏ cạnh tranh.

Tại địa điểm điều tra: lấy mẫu theo 5 điểm chéo góc hoặc 5 điểm ngẫu nhiên hoàn toàn. Dùng bay, thuôn (4.17) lấy đất ở lớp đất mặt có độ sâu từ 0 cm đến 20 cm, kích thước bề mặt mẫu là 15 cm x 15 cm sao cho trọng lượng mẫu đất đạt tối thiểu là 200 g, mẫu đất được đựng trong các túi đựng mẫu (4.9).

Mẫu đất được phơi hoặc sấy khô, sau đó làm tơi đất, để lên khay (4.8), chia đều để lấy 1 phần mẫu khối lượng 200 g, đựng mẫu trong túi đựng mẫu. Dùng sàng (4.4), kích thước mắt sàng lớn hơn 1 mm để sàng tách hạt cỏ ra khỏi đất hoặc có thể hòa mẫu đất vào nước, dùng phễu lọc (4.16) có lót vải thưa để lọc mẫu thu hạt cỏ dại.

6.2  Bảo quản mẫu

6.2.1  Bảo quản tạm thời trong quá trình thu mẫu

- Mẫu để giám định bằng các đặc điểm hình thái: Mỗi mẫu được đặt giữa 4 đến 5 lớp giấy bản (4.14), các mẫu xếp thành tập dày khoảng 20 cm đến 30 cm, buộc chặt tập mẫu theo kiểu chữ thập kép, cho vào túi đựng mẫu (4.9), đổ dung dịch cồn nồng độ 60 % (5.5) vào. Với bó mẫu đã buộc chặt dày từ 20 cm đến 30 cm cần từ 1 000 ml đến 1 500 ml dung dịch cồn. Buộc chặt miệng túi sau khi dồn hết không khí trong túi đựng mẫu ra, đặt túi mẫu nằm cố định một nơi theo chiều ngang mẫu (không đặt túi theo chiều dọc mẫu vì mẫu dễ bị xô lệch), sau 1 đến 2 ngày lật lại túi để dung dịch cồn thấm đều, nếu thấy mặt dưới túi còn ít dung dịch cồn thì cần bổ sung để bảo đảm các mẫu sẽ ngấm đều dung dịch cồn. Phương pháp này có thể bảo quản mẫu được từ 2 đến 6 tháng.

- Mẫu để phân tích DNA cần phải được bảo quản ngay trong túi chứa silicagel (5.10), sau đó được mang về bảo quản trong tủ lạnh sâu (- 20 °C) (4.21) cho tới khi tiến hành làm thí nghiệm phân tích DNA.

6.2.2  Bảo quản mẫu giám định và mẫu lưu sau giám định

Có thể bảo quản theo 1 trong các phương pháp sau:

- Bảo quản mẫu ngâm: xem 7.1.1

- Bảo quản mẫu khô: xem 7.1.2

7  Giám định

7.1  Làm tiêu bản

7.1.1  Tiêu bản ngâm

Cỏ dại (bao gồm toàn bộ cây hoặc các bộ phận của cây như: rễ, thân, hoa, quả và hạt) được làm tiêu bản ngâm theo phương pháp sau: Rửa sạch mẫu cỏ dại thu được đem ngâm trong dung dịch đồng sunfat (CuSO₄) nồng độ 10 % (5.8) trong 24 giờ. Sau đó vớt mẫu vật ra, ngâm rửa lại trong nước sạch và ngâm lại vào dung dịch bảo quản (xem Phụ lục B). Gắn kín nắp lọ bằng parafin (5.6) và cứ 6 tháng thay dung dịch bảo quản một lần.

7.1.2  Tiêu bản khô

Cỏ dại (bao gồm toàn bộ cây hoặc các bộ phận của cây như: thân, hoa, quả và hạt) được làm mẫu tiêu bản khô theo phương pháp sau:

- Ép mẫu: Mẫu sau khi thu thập cần rửa sạch bằng nước cất (5.7); để lên khay men (4.8); dùng dao, kéo (4.10) xử lý sơ bộ mẫu về kích thước cho phù hợp (khổ 42 cm x 30 cm). Có thể ép mẫu bằng các cách sau:

+ Ép mẫu bằng giấy bản: Mỗi mẫu được ép khô bằng cách đặt giữa 4 đến 5 lớp giấy bản (4.14), lần lượt như vậy cho đến khi tập mẫu dầy 25 cm đến 30 cm thì để toàn bộ tập mẫu trong khung gỗ ép mẫu (4.15) và buộc nén chặt lại.

+ Ép mẫu bằng bìa các tông cứng: xếp mỗi mẫu trong 4 đến 5 lớp giấy bản và để vào giữa 2 tấm bìa các tông cứng (4.14), lần lượt làm như vậy cho đến khi tập mẫu dầy 25 cm đến 30 cm thi để toàn bộ tập mẫu trong khung gỗ ép mẫu và buộc nén chặt lại.

+ Ép sấy mẫu có tôn sóng (4.7): Tôn sóng mỏng, nhẹ, khi chèn trong tập mẫu có tác dụng hấp nhiệt, làm tăng nhiệt của giấy bản và bìa các tông, sẽ làm mẫu khô nhanh hơn. Nếu ép mẫu bằng giấy bản thì cứ 3 đến 4 mẫu cho 1 tấm tôn sóng, nếu ép mẫu bằng bìa các tông cứng thì cứ 5 đến 8 mẫu chèn 1 tấm tôn sóng. Tôn sóng phải ở giữa 2 tập giấy bản hay 2 tẩm bìa các tông cứng, không để mẫu ép trực tiếp vào tôn sóng, mẫu sẽ bị cong hay bị quá nóng do tiếp xúc trực tiếp với tôn sóng. Buộc nén chặt cả tập mẫu trong khung gỗ ép mẫu theo kiểu chữ thập kép để ép phẳng mẫu rồi sấy khô.

- Phơi, sấy mẫu: Phơi ngoài trời hoặc sấy khô trong tủ sấy (4.3) nhưng tránh sấy ở nhiệt độ quá cao; nhiệt độ thích hợp từ 45 °C đến 60 °C.

- Mẫu là quả và hạt: Mẫu quả và hạt được phơi ngoài trời hoặc sấy khô trong tủ sấy (4.3), nhiệt độ thích hợp từ 45 °C đến 60 °C cho khô dần đến khi thủy phần hạt đạt 13 %, sau đó chuyển sang lọ nút mài (4.11) để trong tủ định ôn (4.22) hoặc phòng có máy hút ẩm.

- Khâu mẫu đã phơi, sấy khô vào bìa cứng. Quả và hạt cho vào túi giấy không axit (4.12) đính bên cạnh

7.2  Giám định

7.2.1  Giám định bằng phương pháp quan sát các đặc điểm hình thái

- Đối với mẫu cỏ dại là mẫu tươi (mẫu thu hái về giám định ngay không để khô): Giám định bằng phương pháp quan sát các đặc điểm hình thái, đo kích thước, vẽ, chụp ảnh dưới kính lúp soi nổi (4.1) các bộ phận của cây gồm:

+ Thân: Hình dạng, màu sắc, đường kính thân.

+ Lá: Hình dạng, màu sắc, gân lá, kích thước.

+ Hoa: Cấu tạo, hình dạng, kích thước, màu sắc. Hoa được cắt, tách từng bộ phận, để trên lam kính (4.6), nhỏ nước và quan sát

+ Quả: Kích thước, hình dạng, màu sắc của quả.

+ Hạt: Kích thước, hình dạng, màu sắc của hạt, hình dạng của phôi

- Đối với mẫu cỏ dại là mẫu khô: cần ngâm mẫu trong nước ấm, hoặc đun sôi với dung dịch cồn nồng độ 50 % (5.9) trong khoảng vài giây cho đến khi mẫu nở hết (nếu là mẫu hoa); và ngâm mẫu trong nước từ 1 giờ đến 2 giờ (nếu là mẫu thân, quả, hạt). Sau đó quan sát các đặc điểm hình thái, đo kích thước, vẽ, chụp ảnh dưới kính lúp soi nổi (4.1) các bộ phận của cây (tương tự như đối với mẫu cỏ dại là mẫu tươi).

- Sau khi phân tích, xác định tên khoa học của loài cỏ dại dựa trên cơ sở khoa học là việc so sánh, đối chiếu với các tài liệu, khóa định loại.

7.2.2  Giám định bằng phương pháp sinh học phân tử

Tùy từng loài cỏ dại cụ thể, có thể áp dụng các biện pháp sau để định loại tới loài:

- Khuếch đại DNA bằng kỹ thuật PCR

- Mã vạch DNA (DNA barcoding).

- Giải trình tự DNA (DNA sequencing).

8.  Báo cáo kết quả

Nội dung phiếu kết quả giám định gồm những thông tin cơ bản sau:

- Thông tin về mẫu giám định.

- Tên loài

- Phương pháp giám định

- Người giám định/cơ quan giám định

Phiếu kết quả giám định chi tiết có thể tham khảo phụ lục A.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Mẫu phiếu kết quả giám định

PHIẾU KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH

1. Tên hàng hóa:

2. Nước xuất khẩu:

3. Xuất xứ:

4. Phương tiện vận chuyển:                   Khối lượng:

5. Địa điểm lấy mẫu:

6. Ngày lấy mẫu:

7. Người lấy mẫu:

8. Tình trạng mẫu:

9. Ký hiệu mẫu:

10. Số mẫu lưu:

11. Người giám định:

12. Phương pháp giám định: Theo TCVN …………. về “Quy trình giám định cỏ dại gây hại thực vật - Phần 2: Yêu cầu cụ thể đối với ………….. (nêu tên loài cụ thể)”.

13. Kết quả giám định:

Tên khoa học:

Họ:

Bộ:

Phụ lục B

(Quy định)

Dung dịch bảo quản

Có thể sử dụng 1 trong 2 loại dung dịch sau:

B.1  Dung dịch 1

Cách pha

Dùng ống đong (4.18) lấy 1 000 ml nước cất (5.7) đổ vào lọ ngâm mẫu (4.13);

Dùng pipet (4.19) lấy 8 ml axit sunfuric (H₂SO₄) (5.2) nhỏ từ từ vào lọ ngâm mẫu chứa nước cất, dùng đũa thủy tinh (4.5) khuấy đều;

Dùng cân (4.2) cân 50 g natri suntat (Na₂SO₄) (5.3) đổ vào ống đong chứa 50 ml nước cất, khuấy đều cho natri suntat tan hết rồi đổ từ từ dung dịch này vào dung dịch axit đã pha loãng ở trên, dùng đũa thủy tinh khuấy đều cho đến khi hòa tan hoàn toàn.

B.2  Dung dịch 2

Cách pha

Dùng ống đong (4.18) lấy 2 485 ml nước cất (5.7) đổ vào lọ ngâm mẫu (4.13);

Dùng pipet (4.19) lấy 28,4 ml axit sunfurơ (H₂SO₃) (5.4), nhỏ từ từ vào vào lọ ngâm mẫu chứa nước cất, dùng đũa thủy tinh (4.5) khuấy đều;

Dùng cân (4.2) cân 85 g đồng suníat (CuSO₄) (5.1), đổ từ từ vào dung dịch axit đã pha loãng ở trên, dùng đũa thủy tinh khuấy đều cho đến khi hòa tan hoàn toàn.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] CABI (2019). Crop Protection Compedlum

[2] Đường Hồng Dật (1996). Từ điển bách khoa Bảo vệ thực vật, NXB Nông nghiệp.

[3] Nguyễn Văn Dưỡng, Trần Hợp (1970). Kỹ thuật thu hái mẫu vật làm tiêu bản cây cỏ, nhà xuất bản nông thôn.

[4] Nguyễn Nghĩa Thìn (2007). Các phương pháp nghiên cứu thực vật, nhà xuất bản Đại học quốc gia Hà Nội.

[5] TCVN 1-2:2008, Phần 2: Quy định về trình bày và thể hiện nội dung tiêu chuẩn quốc gia..

[6] Viện Bảo vệ thực vật (1997). Phương pháp nghiên cứu Bảo vệ thực vật, Tập 1: Phương pháp điều tra cơ bản dịch hại nông nghiệp và thiên địch của chúng, NXB Nông nghiệp.