Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12463:2018 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố, quy định phương pháp xác định dư lượng narasin và monensin trong sữa bằng phương pháp sắc ký lỏng phổ khối lượng hai lần (LC-MS/MS).
Phạm vi và đối tượng áp dụng của tiêu chuẩn
Tiêu chuẩn này được xây dựng nhằm thiết lập một quy trình phân tích chuẩn xác, thống nhất phục vụ công tác kiểm tra, giám sát an toàn thực phẩm đối với sản phẩm sữa. Phạm vi và đối tượng cụ thể bao gồm:
- Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn quy định phương pháp xác định dư lượng của hai loại chất kháng sinh nhóm ionophore là narasin và monensin trong các sản phẩm sữa tươi, sữa bột và các sản phẩm sữa dạng lỏng khác.
- Đối tượng áp dụng: Áp dụng đối với các phòng thử nghiệm hóa chất, cơ quan kiểm nghiệm an toàn thực phẩm, các doanh nghiệp sản xuất, chế biến, nhập khẩu sữa và các cơ quan quản lý nhà nước có liên quan trong việc kiểm soát dư lượng chất độc hại trong thực phẩm.
Nội dung cốt lõi của tiêu chuẩn (Điều 1 đến Điều 4)
Tiêu chuẩn TCVN 12463:2018 quy định chi tiết các yêu cầu kỹ thuật từ phạm vi, tài liệu viện dẫn đến nguyên tắc phân tích và các loại hóa chất, thuốc thử cần thiết như sau:
1. Phạm vi áp dụng (Điều 1)
Điều này xác định rõ giới hạn và mục tiêu của phương pháp phân tích. Phương pháp sắc ký lỏng phổ khối lượng hai lần (LC-MS/MS) được lựa chọn nhờ độ nhạy cao, độ đặc hiệu vượt trội, cho phép phát hiện và định lượng chính xác dư lượng narasin và monensin ở giới hạn hàm lượng cực thấp (vết) trong nền mẫu sữa phức tạp.
2. Tài liệu viện dẫn (Điều 2)
Để áp dụng tiêu chuẩn này một cách chính xác, người sử dụng cần viện dẫn và tuân thủ các tài liệu kỹ thuật liên quan. Các tài liệu viện dẫn bao gồm các tiêu chuẩn về lấy mẫu sữa và sản phẩm sữa, hướng dẫn chung về chuẩn bị mẫu thử và các quy định kỹ thuật về an toàn phòng thí nghiệm. Việc áp dụng các tài liệu này phải tuân theo phiên bản được nêu cụ thể hoặc phiên bản mới nhất nếu không ghi năm công bố.
3. Nguyên tắc của phương pháp phân tích (Điều 3)
Nguyên tắc phân tích dư lượng narasin và monensin trong sữa dựa trên các bước kỹ thuật nghiêm ngặt sau:
- Chiết xuất mẫu: Dư lượng narasin và monensin trong mẫu sữa được giải phóng và chiết tách bằng cách sử dụng dung môi hữu cơ thích hợp (thường là axetonitril hoặc metanol) kết hợp với quá trình lắc, ly tâm để tách pha lỏng chứa chất phân tích ra khỏi pha rắn (protein và chất béo trong sữa).
- Làm sạch dịch chiết: Dịch chiết thu được sau quá trình ly tâm được làm sạch thông qua kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) hoặc các biện pháp lọc thích hợp nhằm loại bỏ tối đa các hợp chất cản trở (như lipid, protein hòa tan) có thể gây hiệu ứng nền trong quá trình đo phổ khối lượng.
- Phân tách sắc ký: Các chất phân tích sau khi làm sạch được bơm vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) hoặc sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC). Tại đây, narasin và monensin được phân tách ra khỏi các cấu tử khác dựa trên ái lực khác nhau của chúng với pha tĩnh và pha động.
- Phát hiện và định lượng bằng phổ khối lượng hai lần (MS/MS): Quá trình ion hóa được thực hiện bằng kỹ thuật ion hóa phun bụi điện tử (ESI) ở chế độ ion dương. Việc định lượng và xác nhận được thực hiện dựa trên việc theo dõi các mảnh ion đặc trưng (chế độ MRM). Việc sử dụng chất chuẩn nội (internal standard) giúp bù trừ các hao hụt trong quá trình xử lý mẫu và biến động của tín hiệu ion hóa.
4. Thuốc thử và vật liệu thử (Điều 4)
Để đảm bảo độ lặp lại và độ tái lập của kết quả thử nghiệm, tiêu chuẩn đưa ra các yêu cầu khắt khe đối với hóa chất và thuốc thử:
- Yêu cầu về độ tinh khiết: Tất cả các hóa chất, dung môi sử dụng (như axetonitril, metanol, axit formic, amoni axetat) phải đạt độ tinh khiết dùng cho phân tích sắc ký lỏng phổ khối lượng (LC-MS grade) hoặc tối thiểu là loại tinh khiết phân tích (AR grade). Nước sử dụng phải là nước siêu tinh khiết (độ điện trở suất lớn hơn hoặc bằng 18,2 Megaohm-cm).
- Chất chuẩn đối chiếu: Chất chuẩn narasin và monensin phải có chứng nhận xuất xứ rõ ràng, độ tinh khiết tối thiểu thường trên 95%. Các chất chuẩn nội (ví dụ như monensin-d3 hoặc các chất tương đương) được sử dụng để hiệu chuẩn tín hiệu.
- Chuẩn bị và bảo quản dung dịch chuẩn: Dung dịch chuẩn gốc được pha chế bằng cách hòa tan chất chuẩn trong dung môi phù hợp và bảo quản ở nhiệt độ âm (thường dưới -18 độ C) trong các lọ thủy tinh tối màu để tránh phân hủy bởi ánh sáng. Các dung dịch chuẩn làm việc được pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc và chỉ sử dụng trong thời hạn quy định.
Hiệu lực thi hành
Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12463:2018 có hiệu lực áp dụng kể từ ngày được Bộ Khoa học và Công nghệ công bố ban hành. Các tổ chức, phòng thử nghiệm cần cập nhật trang thiết bị, đào tạo nhân lực và thẩm định phương pháp theo đúng các chỉ dẫn kỹ thuật trong tiêu chuẩn này để đảm bảo tính pháp lý và độ chính xác của kết quả phân tích.
SỮA - XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG NARASIN VÀ MONENSIN - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG PHỔ KHỐI LƯỢNG HAI LẦN
Milk - Determination of narasin and monensin residues - Liquid chromatography with tandem mass spectrometric (LC-MS/MS) method
Lời nói đầu
TCVN 12463:2018 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 2011.24 Narasin and monensin in chicken, swine and bovine tissues. LC-MS/MS;
TCVN 12463:2018 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
SỮA - XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG NARASIN VÀ MONENSIN - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG PHỔ KHỐI LƯỢNG HAI LẦN
Milk - Determination of narasin and monensin residues - Liquid chromatography with tandem mass spectrometric (LC-MS/MS) method
CẢNH BÁO: Bảo quản các dung môi trong buồng bảo quản chất lỏng dễ cháy. Các dung môi này gây nguy hiểm nếu hít, nuốt hoặc tiếp xúc qua da. Sử dụng thiết bị bảo vệ cá nhân thích hợp như kính an toàn và găng tay cao su, các thao tác sử dụng dung môi phải thực hiện trong tủ hút. Thải bỏ các vật liệu theo quy định.
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng narasin và monensin trong sữa bằng sắc ký lỏng phổ khối lượng hai lần (LC-MS/MS).
Dải nồng độ phân tích của phương pháp với từng nền mẫu được nêu trong Phụ lục A.
Đồng hóa phần mẫu thử. Dịch chiết được tinh sạch trên cột chiết pha rắn và phân tích bằng LC-MS/MS. Khẳng định việc nhận biết narasin và monensin bằng cách so sánh các sản phẩm ion đo được trong mẫu với các ion trong dung dịch chuẩn và so sánh thời gian lưu trong sắc ký đồ của dung dịch mẫu thử với dung dịch chuẩn.
Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác.
3.1 Nước, nước cất hoặc nước đã khử ion.
3.2 Metanol (CH3OH), loại dùng cho LC.
3.3 Axetonitril (C2H3N), loại dùng cho LC.
3.4 Hexan [CH3(CH2)4CH3], loại dùng cho LC.
3.5 Etyl axetat (CH3COOC2H5), loại dùng cho LC.
3.6 Isooctan [(CH3)3CCH2CH(CH3)2].
3.7 Axit formic (CH2O2).
3.8 Natri sulfat (Na2SO4), khan.
3.9 Dung môi chiết
Cho 500 ml etyl axetat (3.5) vào 4 500 ml isooctan (3.6). Trộn đều.
3.10 Natri bicacbonat (NaHCO3).
3.11 Metanol đã trung hòa
Cho 1 g natri bicacbonat (3.10) vào 1 000 ml metanol (3.2). Trộn kỹ. Lọc qua giấy lọc cỡ lỗ 11 µm, ví dụ Whatman No. 1, nếu cần.
3.12 Dung môi rửa cột chiết pha rắn (SPE) silic dioxit
Cho 500 ml hexan (3.4) vào 500 ml etyl axetat (3.5). Trộn đều.
3.13 Dung môi rửa giải cột chiết pha rắn (SPE) silic dioxit
Cho 200 ml metanol (3.2) vào 800 ml etyl axetat (3.5). Trộn đều.
3.14 Dung dịch pha động A dùng cho sắc ký lỏng
Cho 1 ml axit formic (3.7) vào 1 000 ml nước (3.1). Trộn đều. Lọc khi cần.
3.15 Dung dịch pha động B dùng cho sắc ký lỏng
Cho 5 ml axit formic (3.7) vào 5 000 ml axetonitril (3.3). Trộn đều. Lọc khi cần.
3.16 Chất chuẩn đối chứng muối natri monensin 1), được bảo quản ở 5 °C.
3.17 Chất chuẩn đối chứng narasin 1), được bảo quản ở -10 °C đến -25 °C.
3.18 Chất chuẩn đối chứng nigericin. 2)
3.19 Dung dịch gốc chuẩn monensin, 1 000 µg/ml
Cân 10 mg ± 0,1 mg monensin (3.16), cho vào bình định mức 10 ml (4.2). Hòa tan và thêm metanol đã trung hòa (3.11) đến vạch.
3.20 Dung dịch gốc chuẩn narasin, 1 000 µg/ml
Cân 10 mg ± 0,1 mg chất chuẩn đối chứng narasin (3.17), cho vào bình định mức 10 ml (4.2). Hòa tan và pha loãng bằng metanol đã trung hòa (3.11) đến vạch.
3.21 Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp, 10 µg/ml.
Cho 1 ml của mỗi dung dịch chuẩn gốc [monensin (3.19) và narasin (3.20)] vào bình định mức 100 ml (4.2) và thêm metanol đã trung hòa (3.11) đến vạch.
3.22 Dung dịch dùng cho đường chuẩn
Pha loãng dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp (3.21) bằng metanol đã trung hòa (3.11), dùng sơ đồ pha loãng như trong Bảng 1 để chuẩn bị các dung dịch dùng cho đường chuẩn.
Bảng 1 - Chuẩn bị dung dịch monensin và narasin dùng cho đường chuẩn
| Nồng độ chất chuẩn, | Thể tích dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp (3.21), | Thể tích cuối cùng, | Nồng độ cuối cùng, | Loại mẫu a) |
| 10000 | 1 | 20 | 500 | C |
| 10000 | 2,2 | 50 | 440 | C |
| 10000 | 2 | 50 | 400 | C |
| 10000 | 1,6 | 50 | 320 | C |
| 10000 | 0,8 | 50 | 160 | C |
| 10000 | 0,5 | 50 | 100 | B,C,S |
| 10000 | 0,4 | 50 | 80 | B,C,S |
| 500 | 4 | 50 | 40 | B,C,S |
| 500 | 2 | 50 | 20 | B,C,S |
| 500 | 1 | 50 | 10 | B,C,S |
| 500 | 0,5 | 50 | 5 | B,C,S |
| 500 | 0,25 | 50 | 2,5 | B,C,S |
| 500 | 0,1 | 50 | 1 | B,C,S |
| 500 | 0,05 | 50 | 0,5 | B,C,S |
| 500 | 0,025 | 50 | 0,25 | B |
| a) B: Bò, C: gà, S: lợn. | ||||
3.23 Dung dịch nội chuẩn gốc, 1 000 µg/ml
Cân 10 mg ± 0,1 mg chất chuẩn đối chứng nigericin (3.18), cho vào bình định mức 10 ml (4.2). Hòa tan và pha loãng bằng metanol đã trung hòa (3.11) đến vạch.
3.24 Dung dịch nội chuẩn làm việc, 1 µg/ml
Cho 0,05 ml dung dịch nội chuẩn gốc (3.23) vào bình định mức 50 ml (4.2) và pha loãng bằng etyl axetat (3.5) đến vạch.
3.25 Dung dịch chuẩn gốc kiểm soát chất lượng (QC) monensin, 1 000 µg/ml
Cân 10 mg ± 0,1 mg monensin (3.16), cho vào bình định mức 10 ml (4.2). Hòa tan và pha loãng bằng metanol đã trung hòa (3.11) đến vạch.
3.26 Dung dịch chuẩn gốc QC narasin, 1 000 µg/ml
Cân 10 mg ± 0,1 mg chất chuẩn đối chứng narasin (3.17), cho vào bình định mức 10 ml (4.2). Hòa tan và pha loãng bằng metanol đã trung hòa (3.11) đến vạch.
3.27 Dung dịch QC monensin, 20 µg/ml
Cho 1 ml dung dịch chuẩn gốc QC monensin (3.25) vào bình định mức 50 ml (4.2) và thêm etyl axetat (3.5) đến vạch.
3.28 Dung dịch bổ sung QC monensin
Pha loãng dung dịch QC monensin (3.27) trong etyl axetat (3.5), dùng sơ đồ pha loãng như trong Bảng 2.
Bảng 2 - Chuẩn bị dung dịch bổ sung kiểm soát chất lượng monensin
| Nồng độ monensin, µg/ml | Thể tích dung dịch QC monensin (3.27), ml | Thể tích cuối cùng, ml | Nồng độ cuối cùng, ng/ml | Nồng độ nền mẫu, ng/ga |
| 20 | 4 | 20 | 4000 | 200 |
| 20 | 2 | 20 | 2000 | 100 |
| 20 | 1,5 | 25 | 1200 | 60 |
| 20 | 1 | 20 | 1000 | 50 |
| 20 | 0,75 | 25 | 600 | 30 |
| 20 | 0,5 | 20 | 500 | 25 |
| 20 | 0,5 | 25 | 400 | 20 |
| 20 | 0,3 | 20 | 300 | 15 |
| 20 | 0,25 | 20 | 250 | 12,5 |
| 20 | 0,25 | 25 | 200 | 10 |
| 20 | 0,2 | 25 | 160 | 8 |
| 20 | 0,125 | 25 | 100 | 5 |
| 20 | 0,1 | 25 | 80 | 4 |
| 20 | 0,05 | 25 | 40 | 2 |
| 20 | 0,025 | 25 | 20 | 1 |
| a Nồng độ nền mẫu được tính theo thể tích 250 µl bổ sung đối với 5 g nền mẫu. Chuẩn bị dung dịch bổ sung kiểm soát chất lượng dựa vào MRL hoặc dùng sai của nền mẫu được phân tích. | ||||
3.29 Dung dịch QC narasin, 20 µg/ml
Cho 1 ml dung dịch chuẩn gốc QC narasin (3.26) vào bình định mức 50 ml (4.2). Hòa tan và thêm etyl axtetat (3.5) đến vạch.
3.30 Dung dịch bổ sung QC narasin
Pha loãng các dung dịch QC narasin 1 000 µg/ml (3.25) và 20 µg/ml (3.29) trong etyl axtetat (3.5), dùng sơ đồ pha loãng như trong Bảng 3.
Bảng 3 - Chuẩn bị dung dịch bổ sung kiểm soát chất lượng narasin
| Nồng độ narasin, µg/ml | Thể tích dung dịch QC narasin (3.25 hoặc 3.29), ml | Thể tích cuối cùng ml | Nồng độ cuối cùng ng/ml | Nồng độ nền mẫu ng/ga |
| 1000 | 0,96 | 50 | 19200 | 960 |
| 1000 | 0,48 | 50 | 9600 | 480 |
| 1000 | 0,24 | 50 | 4800 | 240 |
| 20 | 2,5 | 25 | 2000 | 100 |
| 20 | 1,25 | 25 | 1000 | 50 |
| 20 | 0,75 | 25 | 600 | 30 |
| 20 | 0,5 | 20 | 500 | 25 |
| 20 | 0,3 | 20 | 300 | 15 |
| 20 | 0,15 | 20 | 150 | 7,5 |
| a Nồng độ nền mẫu được tính theo thể tích 250 µl bổ sung đối với 5 g nền mẫu. Chuẩn bị dung dịch bổ sung kiểm soát chất lượng dựa vào MRL hoặc dung sai của nền mẫu được phân tích. | ||||
CHÚ THÍCH Có thể chuẩn bị các chất chuẩn với thể tích khác nhau với điều kiện có cùng nồng độ. Dung dịch gốc có thể được chỉnh đối với độ tinh khiết của chất chuẩn đối chứng trong suốt quá trình chuẩn bị. Các dung dịch gốc và cất chuẩn hiệu chuẩn bền đến 35 ngày khi được bảo quản ở 4 °C.
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
4.1 Pipet định mức, loại A, bằng thủy tinh, có các kích cỡ thích hợp hoặc pipet dịch chuyển dương.
4.2 Bình định mức, loại A, có các dung tích thích hợp.
4.3 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến ± 0,00001 g.
4.4 Cân, có thể cân chính xác đến ± 0,01 g.
4.5 Ống đong chia vạch, bằng thủy tinh, kích cỡ các loại.
4.6 Ống ly tâm bằng polypropylen, đáy nhọn, dung tích 50 ml, có nắp đậy.
4.7 Máy ly tâm lạnh, có thể hoạt động với gia tốc 1734 g.
4.8 Máy trộn vortex nhiều ống.
4.9 Máy làm khô bằng nitơ, ví dụ: Techne DB-3A dri-block 3) hoặc loại tương đương.
4.10 Bộ phân phối chân không, có khóa bằng PTFE và giá để ống nghiệm dài 16 mm hoặc loại tương đương.
4.11 Bể siêu âm.
4.12 Cột chiết pha rắn (SPE), ví dụ: Waters silica Sep-Pak Plus 690 mg hoặc Waters silica Sep-Pak Vac 6 ml, 500 mg 4).
4.13 Hệ thống sắc ký lỏng phổ khối lượng hai lần, loại ba tứ cực, ví dụ API 4000 5) hoặc loại tương đương.
4.14 Hệ thống sắc ký lỏng, ví dụ: Waters 2695 4), hoặc loại tương đương.
4.15 Cột sắc ký lỏng, ví dụ: Aqua C18,150 mm x 2,0 mm, cỡ hạt 5 µm 6), hoặc loại tương đương.
4.16 Nồi cách thủy, có thể kiểm soát ở nhiệt độ nhất định.
Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.
Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707) Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu.
6.1 Chuẩn bị mẫu thử
6.1.1 Đồng hóa và bảo quản mẫu
Cho 5,0 g ± 0,1 g mẫu vào ống ly tâm 50 ml (4.6) trộn bằng máy trộn vortex (4.8) để đồng hóa.
Bảo quản tất cả mẫu ở nhiệt độ - 20 °C hoặc thấp hơn khi chưa xử lý hoặc chưa lấy phần mẫu thử. Nên bảo quản mẫu bổ sung cùng với các mẫu phân tích để xác nhận tính ổn định khi bảo quản. Mẫu có thể được làm lạnh đến 72 h. Có thể đông lạnh sữa để bảo quản, nếu cần. Sữa để bảo quản cần phải đồng nhất vì sẽ khó đồng hóa sau khi rã đông.
6.1.2 Chuẩn bị phần mẫu kiểm soát chất lượng và phần mẫu thử kiểm soát
6.1.2.1 Chuẩn bị tối thiểu ba phần mẫu kiểm soát trong ngày phân tích.
a) Cho vào mỗi phần nền mẫu 500 µl dung dịch nội chuẩn vào 5,0 g ± 0,1 g phần mẫu kiểm soát chất lượng và trộn đều.
b) Có thể lấy nhiều phần dịch lỏng SPE từ mỗi phần mẫu kiểm soát (khoảng ba phần từ mỗi phần mẫu thử). Xác định số phần dịch lỏng cần thiết đối với các dung dịch chuẩn tương ứng với nền mẫu và các phần dịch lỏng còn lại làm kiểm soát âm tính (hai phần đối với các mẫu kiểm soát; các phần dịch lỏng còn lại có thể được dùng để pha loãng, nếu cần).
6.1.2.2 Chuẩn bị các phần mẫu thử 5,0 g ± 0,1 g kiểm soát chất lượng bổ sung, trong ngày phân tích.
a) Thêm các dung dịch bổ sung QC monensin và narasin kiểm soát chất lượng (3.28 và 3.30) vào phần mẫu thử, nếu cần.
b) Cho 500 µl dung dịch nội chuẩn (3.24) vào 5,0 g ± 0,1 g phần mẫu thử và trộn đều.
6.1.2.3 Dung dịch bổ sung kiểm soát chất lượng và dung dịch nội chuẩn được thêm vào các phần mẫu kiểm soát chất lượng và phần mẫu thử kiểm soát, trộn đều bằng máy trộn vortex (4.8) và để yên phần mẫu thử trong khoảng 10 min đến 30 min trước khi bắt đầu tiến hành quy trình chiết.
6.1.2.4 Thực hiện đối với các mẫu kiểm soát chất lượng và mẫu kiểm soát như nêu trong quy trình chiết trong 6.2.
6.2 Chiết mẫu
a) Chuẩn bị theo 6.1.
b) Thêm 15 ml ± 1 ml dung môi chiết và trộn đều bằng cách đảo chiều nhẹ vật chứa (20 lần).
CHÚ THÍCH Trộn mạnh có thể tạo nhũ tương thể vẩn làm nhiễu phép phân tích.
c) Ly tâm 5 min với gia tốc khoảng 1734 g (4.7) ở 4 °C.
d) Làm đông lạnh lớp phía dưới bằng cách cho ống vào tủ đông giữ ở - 80 °C trong 15 min đến 20 min.
CHÚ THÍCH Có thể để trong tủ đông ở - 20 °C, nhưng thời gian cấp đông phải được chỉnh tương ứng.
e) Gạn dịch lỏng vào ống đong chia vạch dung tích 50 ml (4.5).
f) Đặt ống trong nồi cách thủy (4.16) để ở 35 °C khoảng 5 min để hóa lỏng lượng chứa
g) Thêm lần hai, 15 ml ± 1 ml dung môi chiết vào sữa và trộn đều bằng cách đảo chiều nhẹ (20 lần).
h) Ly tâm 10 min ở khoảng 1734 g và 4 °C.
i) Làm đông lạnh lớp phía dưới bằng cách giữ ống ở - 80 °C từ 15 min đến 20 min.
CHÚ THÍCH Có thể để trong tủ đông ở - 20 °C, nhưng thời gian cấp đông phải được chỉnh tương ứng.
k) Gạn dịch lỏng vào bình nón hoặc ống đong chia vạch dung tích 50 ml (4.5).
l) Để hỗn hợp dịch chiết cân bằng đến nhiệt độ phòng sau đó thêm dung môi chiết vừa đủ đến 30 ml.
m) Thêm 2,0 g ± 0,2 g natri sulfat khan (3.8) và trộn bằng máy trộn vortex (4.8) trong 5 min.
n) Dùng máy li tâm (4.7), li tâm 5 min ở khoảng 1734 g và 4 °C.
o) Tiến hành tiếp theo 6.3.
6.3 Tinh sạch bằng SPE silic dioxit
a) Gắn cột SPE silic dioxit (4.12) vào bộ phân phối chân không (4.10).
b) Thêm 1,0 g ± 0,2 g natri sulfat khan (3.8) vào đáy cột SPE (4.12) và làm ẩm với khoảng 5 ml metanol (3.2), sau đó là 5 ml etyl axtetat (3.5) và 5 ml dung môi chiết (3.9), để dung môi khô đến bề mặt của cột.
c) Chuyển 5 ml dịch chiết mẫu lên cột SPE (4.12) và cho chảy đến khô trên bề mặt cột ở tốc độ dòng khoảng 2 ml/min. Loại bỏ nước thải của cột.
d) Rửa cột bằng 5 ml hexan (3.4) và loại bỏ nước thải.
e) Rửa cột bằng 3 ml dung môi rửa (3.12) và loại bỏ nước thải.
f) Khi dùng cột SPE Waters Sep-Pak Plus thì rửa giải bằng 5 ml dung môi rửa giải (3.13) vào trong ống nghiệm. Khi dùng cột SPE Waters Sep-Pak Vac thì rửa giải bằng 8 ml dung môi rửa giải (3.13) vào ống nghiệm.
g) Làm bay hơi dịch rửa giải đến khô dưới dòng nitơ, dùng máy làm khô bằng nitơ (4.9) trong nồi cách thủy ở 35 °C đến 40 °C (4.16). Lấy ống nghiệm ra khỏi bộ bay hơi ngay khi dịch rửa giải đạt trạng thái khô.
h) Hòa tan cặn bằng 1,0 ml metanol (3.2). Đối với dịch chiết kiểm soát được dùng làm chất chuẩn tương ứng với nền mẫu, hòa tan bằng 1,0 ml dung dịch dùng cho đường chuẩn (3.22) thích hợp.
i) Trộn bằng máy trộn vortex (4.8) trong 15 s, siêu âm 2 min và trộn lại bằng máy trộn vortex.
j) Chuyển vào lọ LC để phân tích LC-MS/MS.
CHÚ THÍCH Nếu phần mẫu thử có chứa hàm lượng chất phân tích cao hơn hoặc nghi ngờ cao hơn dải đường chuẩn thì pha loãng với thể tích xác định của dịch chiết kiểm soát.
6.4 Xác định
6.4.1 Điều kiện vận hành sắc ký lỏng
Các điều kiện vận hành sau đây được cho là thích hợp:
- Nhiệt độ cột: 40 °C;
- Nhiệt độ của bộ bơm mẫu tự động: 5°C;
- Thể tích bơm: 2 µl;
- Thời gian chạy: 10 min;
- Thời gian lưu: monensin 2,28 min, narasin 2,27 min, nigericin 2,88 min;
- Gradient: xem Bảng 4.
Bảng 4 - Các điều kiện gradient dùng cho sắc ký lỏng
| Thời gian, min | Tốc độ dòng, ml/min | Pha động A (3.14), % | Pha động B (3.15), % |
| 0 | 0,6 | 5 | 95 |
| 5,4 | 0,6 | 5 | 95 |
| 5,5 | 1,1 | 0 | 100 |
| 8,4 | 1,1 | 0 | 100 |
| 8,5 | 0,6 | 5 | 95 |
| 10 | 0,6 | 5 | 95 |
6.4.2 Điều kiện vận hành LC-MS/MS
Các thông số phổ khối lượng được đưa ra thấp hơn giá trị đề xuất đối với thiết bị API 4000 (4.13). Để tối ưu hóa phép phân tích, chỉnh thiết bị để thu được các thông số phổ khối lượng. Chế độ vận hành đối với thiết bị API 4000: ion dương, kiểm soát đa phản ứng (MRM); quá trình chuyển tiếp: xem Bảng 5.
Bảng 5 - Điều kiện vận hành máy đo phổ khối lượng: quá trình chuyển tiếp
| Hợp chất | Xác định | Khẳng định |
| Monensin | 693,5 " 675,5 | 693,5 " 675,5 693,5 " 501,6 693,5 " 479,4 |
| Narasin | 787,5 " 431,3 | 787,5 " 431,3 787,5 " 531,4 787,5 " 279,2 |
| Nigericin | 747,6 " 729,6 |
|
6.4.3 Các thông số máy đo phổ khối lượng
Xem Bảng 6 về các thông số đối với máy API 4000 (4.13).
Bảng 6 - Các thông số phổ khối lượng
| Hợp chất | Khối lượng Q1 amu | Khối lượng Q3 amu | Thế bắn phá (CE) volt | Điện thế bắn đầu ra (CXP) volt | |
| Monensin | 693,5 | 675,5 501,6 479,4 | 50 67 70 | 22 18 16 | |
| Narasin | 787,5 | 431,3 531,4 279,2 | 67 60 73 | 15 19 21 | |
| Nigericin | 747,6 | 729,6 | 55 | 25 | |
| Nguồn ion: Độ phân giải (Q1 và Q3): Thời gian ngưng: Va chạm hoạt hóa phân ly (CAD): Khí chắn (CUR): Khí 1 (GS1): Khí 2 (GS2): Điện áp phun ion (IS): Điện thế bắn phá (DP): Điện thế đầu vào (EP): Nhiệt độ (TEM): Bộ làm nóng bề mặt (ihe): | Turbospray đơn vị 250 ms 12 20 50 20 5500 V 70 V 12 V 700 °C bật | ||||
a) Đảm bảo rằng hệ LC-MS/MS thích hợp được cân bằng theo khuyến cáo của nhà sản xuất trước khi phân tích mẫu.
b) Bơm 2 µl metanol (3.2) hoặc metanol đã trung hòa (3.11) (đã dùng để định mức các thể tích mẫu và thể tích dung dịch chuẩn) và quan sát không có chất gây nhiễu sắc ký có mặt ở thời gian lưu của monensin hoặc narasin.
c) Bơm 2 µl dung dịch chuẩn tương ứng với nền mẫu monensin ở mức dung sai hoặc gần mức dung sai và quan sát pic monensin có mặt ở thời gian lưu dự kiến đối với m/z 693 > 675, 693 > 501 và 693 > 479. Thể tích bơm phải được chỉnh để tạo tỷ lệ tín hiệu/nhiễu (S/N) 100 : 1 đối với chất chuẩn tương ứng với dung sai. Tỷ lệ S/N đối với tất cả ba lần chuyển tiếp MS/MS trong chất chuẩn và mẫu phải lớn hơn 3.
CHÚ THÍCH Các thể tích bơm lớn hơn có thể làm cho các mẫu kiểm soát chứa monensin nhỏ hơn 10 % so với dung sai đáp ứng tiêu chí khẳng định.
d) Bơm 2 µl dung dịch chuẩn tương ứng với nền mẫu narasin ở mức dung sai hoặc gần mức dung sai và quan sát pic narasin có mặt ở thời gian lưu dự kiến đối với m/z 787 > 531, 787 > 431 và 787 > 279. Thể tích bơm phải được chỉnh để tạo tỷ lệ S/N 100 : 1 đối với chất chuẩn tương ứng với dung sai. Tỷ lệ S/N đối với tất cả ba lần chuyển tiếp MS/MS trong chất chuẩn và mẫu phải lớn hơn 3.
CHÚ THÍCH Các thể tích bơm lớn hơn có thể làm cho các mẫu kiểm soát chứa monensin nhỏ hơn 10 % so với dung sai đáp ứng tiêu chí khẳng định.
e) Nếu thay đổi các nền mẫu hoặc bắt đầu lần chạy mới trên hệ thống LC-MS/MS thì cần bơm đủ số lần bơm ổn định do trôi hệ thống. Nên bơm khoảng 20 lần.
f) Bơm các lần riêng rẽ các dung dịch chuẩn tương ứng với nền mẫu và các lần bom riêng rẽ các dịch chiết mẫu. Nên bơm một dãy dung dịch chuẩn hoàn chỉnh ở thời điểm bắt đầu và kết thúc từng dãy mẫu.
g) Đo diện tích pic của chất phân tích: tỷ số diện tích pic nội chuẩn đối với monensin và narasin trong các dung dịch chất chuẩn, kiểm soát chất lượng và phần mẫu thử chưa biết.
6.5 Dựng đường chuẩn
a) Dựng đường chuẩn từ các dung dịch chuẩn (3.22), sử dụng phép phân tích hồi quy tuyến tính bình phương nhỏ nhất của tỷ lệ diện tích pic so với nồng độ của dung dịch chuẩn. Đường chuẩn không đi qua gốc tọa độ.
b) Thiết lập độ tuyến tính của hệ thống bằng cách phân tích phần không tuyến tính của đường chuẩn.
- Các phần không tuyến tính cho thấy mô hình ngẫu nhiên khi được dựng đồ thị theo nồng độ.
- Các dung dịch hiệu chuẩn có thể bị loại khi ít nhất 75 % toàn bộ dung dịch hiệu chuẩn vẫn còn phần không tuyến tính không lớn hơn 15 % ở tất cả các mức (trừ dung dịch hiệu chuẩn thấp nhất 20 % là có thể chấp nhận) và bao gồm ít nhất năm nồng độ hiệu chuẩn trong đường chuẩn cuối cùng.
Nồng độ narasin và monensin trong mẫu thử, X, biểu thị bằng nanogam trên gam (ng/g), được tính theo Công thức (1):
(1)
Trong đó
PAR là tỷ lệ diện tích pic của mỗi chất phân tích so với diện tích pic của chất nội chuẩn tương ứng;
c là giao điểm với trục tung, xác định được từ phép phân tích hồi quy của đường chuẩn;
m là độ dốc của đường thẳng từ phân tích hồi quy đường chuẩn;
CF là hệ số hiệu chính đối với độ pha loãng, nếu có, được tính bằng Công thức (2):
(2)
Trong đó:
V1 là thể tích cuối cùng của dịch chiết mẫu, tính bằng mililít (ml);
V2 là thể tích dịch chiết thu được ban đầu, tính bằng mililít (ml);
b là thể tích dịch chiết đã sử dụng cho tinh sạch bằng SPE, tính bằng mililít (ml);
m là khối lượng mẫu, tính bằng gam (g).
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử;
b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;
e) kết quả thử nghiệm thu được.
Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm
Bảng A.1 - Dải phân tích đối với dư lượng monensin và narasin trong mẫu
| Nền mẫu | Dải mg/ml | Nồng độ nền mẫu tương đươnga ng/g |
| Sữa bò | từ 0,25 đến 40 | từ 0,30 đến 48 |
| a Nồng độ tương đương được hiệu chính với hệ số pha loãng phân tích tương ứng. | ||
1) Có sẵn từ Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN, USA. Thông tin này được đưa ra nhằm tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng các sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.
2) Có sẵn từ Sigma-Aldrich, Gillingham, Dorset, UK. Thông tin này được đưa ra nhằm tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng các sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.
3) Sản phẩm của Bibby Scientific Ltd., Staffordshire, UK. Thông tin này được đưa ra nhằm tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng các sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.
4) Các sản phẩm của Waters, Milford, MA, USA. Thông tin này được đưa ra nhằm tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng các sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.
5) Sản phẩm của Applied Biosystem, CA, USA. Thông tin này được đưa ra nhằm tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng các sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.
6) Sản phẩm của Phenomenex, Torrance, CA, USA. Thông tin này được đưa ra nhằm tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng các sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho kết quả tương đương.
- 1 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6838:2011 (ISO 12081 : 2010) về Sữa – Xác định hàm lượng canxi – Phương pháp chuẩn độ
- 2 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8899:2012 (ISO/TS 11059:2009) về Sữa và sản phẩm sữa - Phương pháp định lượng pseudomonas spp
- 3 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10714:2015 (ISO 11053:2009) về Dầu, mỡ thực vật - Xác định đương lượng bơ cacao trong sôcôla sữa
- 4 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12628:2019 về Sữa và thực phẩm công thức dành cho trẻ sơ sinh - Xác định hàm lượng cholin bằng phương pháp đo màu
- 1 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 6400:2010 (ISO 707:2008/IDF 50:2008) về Sữa và các sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu
- 2 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6838:2011 (ISO 12081 : 2010) về Sữa – Xác định hàm lượng canxi – Phương pháp chuẩn độ
- 3 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8899:2012 (ISO/TS 11059:2009) về Sữa và sản phẩm sữa - Phương pháp định lượng pseudomonas spp
- 4 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10714:2015 (ISO 11053:2009) về Dầu, mỡ thực vật - Xác định đương lượng bơ cacao trong sôcôla sữa
- 5 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12628:2019 về Sữa và thực phẩm công thức dành cho trẻ sơ sinh - Xác định hàm lượng cholin bằng phương pháp đo màu