Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 14243:2024 về Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng urê và nitơ amoniac - Phương pháp ureaza do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia biên soạn và Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. Tiêu chuẩn này quy định phương pháp phân tích hóa học nhằm xác định chính xác hàm lượng urê và nitơ amoniac có trong các sản phẩm thức ăn chăn nuôi và nguyên liệu sản xuất thức ăn chăn nuôi.
Phạm vi áp dụng và đối tượng điều chỉnh
Tiêu chuẩn này áp dụng đối với tất cả các loại thức ăn chăn nuôi thương mại, thức ăn hỗn hợp, thức ăn đậm đặc và các loại nguyên liệu đơn có bổ sung hoặc chứa các hợp chất nitơ phi protein (như urê và muối amoni). Phương pháp này giúp các phòng thử nghiệm, cơ quan kiểm định chất lượng và các doanh nghiệp sản xuất kiểm soát hàm lượng urê ở mức an toàn, tránh nguy cơ gây ngộ độc cho vật nuôi, đặc biệt là nhóm động vật nhai lại.
Nguyên lý của phương pháp ureaza
- Mẫu thử được hòa tan trong nước và xử lý bằng enzym ureaza hoạt tính để tiến hành quá trình thủy phân. Enzym ureaza sẽ xúc tác chuyển hóa hoàn toàn urê có trong mẫu thành amoniac và cacbon dioxit.
- Lượng amoniac sinh ra từ phản ứng thủy phân, kết hợp với lượng nitơ amoniac có sẵn ban đầu trong mẫu, được giải phóng ra ngoài bằng phương pháp chưng cất hơi nước trong môi trường kiềm nhẹ.
- Khí amoniac bay hơi được hấp thụ hoàn toàn vào dung dịch axit boric dư.
- Tiến hành chuẩn độ lượng amoniac hấp thụ được bằng dung dịch axit tiêu chuẩn (như axit clohydric hoặc axit sunfuric) để xác định tổng hàm lượng nitơ. Hàm lượng urê được tính toán gián tiếp thông qua sự chênh lệch giữa tổng lượng nitơ sau thủy phân và lượng nitơ amoniac tự do xác định được từ mẫu không qua xử lý enzym.
Yêu cầu về thiết bị, dụng cụ và hóa chất
- Enzym ureaza: Phải có hoạt độ hoạt tính cao, đảm bảo phân hủy hoàn toàn urê trong thời gian quy định và không chứa tạp chất amoniac gây sai lệch kết quả.
- Thiết bị chưng cất: Sử dụng hệ thống chưng cất Kjeldahl thông thường hoặc hệ thống chưng cất hơi nước bán tự động/tự động.
- Thiết bị chuẩn độ: Buret chuẩn độ có độ chính xác cao hoặc máy chuẩn độ tự động được hiệu chuẩn định kỳ.
- Hóa chất và thuốc thử: Dung dịch axit boric nồng độ phù hợp, chất chỉ thị màu hỗn hợp (đỏ metyl và xanh metylen), dung dịch natri hydroxit hoặc magie oxit để kiềm hóa, và dung dịch axit chuẩn độ đã biết trước nồng độ chính xác.
Quy trình tiến hành thử nghiệm
- Chuẩn bị mẫu thử: Mẫu thức ăn chăn nuôi phải được nghiền nhỏ, trộn đều và đi qua sàng có kích thước lỗ tiêu chuẩn để đảm bảo tính đồng nhất tối đa trước khi cân phân tích.
- Quá trình thủy phân bằng enzym: Cân một lượng mẫu xác định vào bình định mức, thêm nước cất và dung dịch enzym ureaza. Tiến hành ủ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng hoặc nhiệt độ ấm theo quy định trong khoảng thời gian xác định để phản ứng thủy phân diễn ra hoàn toàn.
- Chưng cất giải phóng amoniac: Chuyển toàn bộ hỗn hợp sau thủy phân vào bình chưng cất, thêm chất kiềm hóa để nâng pH, tiến hành chưng cất hơi nước ngay lập tức và dẫn khí amoniac vào bình hứng chứa sẵn dung dịch axit boric.
- Chuẩn độ xác định hàm lượng: Tiến hành chuẩn độ dung dịch trong bình hứng bằng dung dịch axit chuẩn cho đến khi dung dịch chuyển màu chỉ thị rõ rệt hoặc đạt đến điểm tương đương trên máy đo pH.
- Thực hiện mẫu trắng: Tiến hành một phép thử trắng song song trong cùng điều kiện nhưng không có mẫu thử để hiệu chỉnh sai số do hóa chất và dụng cụ gây ra.
Tính toán và biểu thị kết quả
- Hàm lượng nitơ amoniac và hàm lượng urê được tính bằng phần trăm khối lượng (%) dựa trên thể tích dung dịch axit chuẩn tiêu tốn cho mẫu thử và mẫu trắng, nồng độ đương lượng của axit và khối lượng mẫu cân.
- Kết quả cuối cùng được biểu thị chính xác đến hai chữ số thập phân.
- Tiêu chuẩn quy định cụ thể về độ chụm, giới hạn độ lặp lại (r) và độ tái lập (R) giữa các lần đo độc lập nhằm đảm bảo tính khách quan và độ tin cậy cao nhất của phép phân tích.
Hiệu lực thi hành
TCVN 14243:2024 có hiệu lực áp dụng kể từ ngày ban hành, thay thế hoặc bổ sung cho các phương pháp thử cũ nhằm tiệm cận với các tiêu chuẩn quốc tế hiện hành trong lĩnh vực phân tích thức ăn chăn nuôi. Các phòng thử nghiệm được chỉ định và các tổ chức chứng nhận sự phù hợp có trách nhiệm cập nhật quy trình kỹ thuật theo tiêu chuẩn này.
TIÊU CHUẨN QUỐC GIA
TCVN 14243:2024
THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG URÊ VÀ NITƠ AMONIAC - PHƯƠNG PHÁP UREAZA
Animal feeding stuffs - Determination of urea and ammoniacal nitrogen content - Urease method
Lời nói đầu
TCVN 14243:2024 được xây dựng dựa theo AOAC 941.04 Urea and Ammoniacal Nitrogen in Animal Feed;
TCVN 14243:2024 do Viện Chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ thẩm định và công bố.
THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG URÊ VÀ NITƠ AMONIAC - PHƯƠNG PHÁP UREAZA
Animal feeding stuffs - Determination of urea and ammoniacal nitrogen content - Urease method
1 Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng urê và nitơ amoniac trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp sử dụng enzyme ureaza.
2 Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau là rất càn thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi (nếu có).
TCVN 6952 (ISO 9498) Thức ăn chăn nuôi- Chuẩn bị mẫu thử.
3 Nguyên tắc
Urê trong mẫu bị enzyme ureaza thủy phân thành ammoniac và CO2, chưng cất amoniac bằng thiết bị Kjeldahl. Định lượng amoniac bằng chuẩn độ axit-bazơ. Hàm lượng nitơ được tính từ lượng amoniac tạo thành.
4 Thuốc thử và vật liệu thử
Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và nước được sử dụng là nước cất 1 lần, nước đã loại khoáng hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác.
4.1 Chất chống tạo bọt, loại nhũ tương chống tạo bọt
Ví dụ Silicon, parafin dạng lỏng.
4.2 Chỉ thị methyl đỏ
Hòa tan 1 g methyl đỏ trong 100 mL metanol
4.3 Dung dịch axit clohydric (HCI), 0,1 M
4.4 Dung dịch ureaza
Chuẩn bị dung dịch mới bằng cách hòa tan ureaza đã chuẩn hóa trong nước sao cho mỗi 10 mL dung dịch trung hòa sẽ chuyển đổi lượng nitơ của tối thiểu 0,1 g urê tinh khiết.
Cách chuẩn hóa:
Để xác định độ kiềm của chế phẩm ureaza, hòa tan 0,1 g ureaza trong 50 mL nước và chuẩn độ bằng axit clohydric 0,1 M (4.3), sử dụng chỉ thị methyl đỏ (4.2). Thêm cùng một thể tích axit clohydric 0,1 M cho mỗi 0,1 g ureaza để chuẩn bị dung dịch ureaza. Để xác định hoạt độ enzyme của chế phẩm, chuẩn bị khoảng 50 mL dung dịch 1 % ureaza đã trung hòa ở trên. Thêm các lượng khác nhau của dung dịch này vào 0,1 g mẫu urê tinh khiết và sau đó thực hiện phân hủy bằng enzyme và chưng cất như trong cách tiến hành theo Điều 8. Tính hoạt độ của chế phẩm ureaza từ lượng dung dịch ureaza đã dùng để chuyển hóa hoàn toàn lượng urê, xác định bằng cách thu hồi toàn bộ lượng nitơ sinh ra từ chưng cất.
4.5 Dung dịch canxi clorua
Hòa tan 25 g canxi clorua dạng khan vào 100 ml nước.
4.6 Magie oxit, MgO.
Độ tinh khiết 98,5 %
4.7 Dung dịch hydroxit natri chuẩn (NaOH), xem Phụ lục A.
4.8 Dung dịch axit clohydric chuẩn (HCI), xem Phụ lục B.
5 Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thủy tinh của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
5.1 Máy chưng cất Kjeldahl.
5.2 Pipet, có dung tích 10 ml.
5.3 Bếp gia nhiệt, có thể duy trì nhiệt độ ở 40 °C.
6 Lấy mẫu
Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 4325 (ISO 6497) Thức ăn chăn nuôi - Lấy mẫu.
7 Chuẩn bị mẫu thử
Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 9498).
8 Cách tiến hành
8.1 Chuẩn độ dịch chưng cất mẫu thử
Cho 2 g phần mẫu thử vào bình Kjeldahl của thiết bị chưng cất (5.1), thêm khoảng 250 mL nước. Thêm 10 mL dung dịch ureaza (4.4), đậy kín nắp bình và để yên 1 h ở nhiệt độ phòng hoặc 20 min ở 40 °C trên bếp gia nhiệt (5.3). Làm mát đến nhiệt độ phòng nếu cần. Sử dụng thêm dung dịch ureaza nếu mẫu thức ăn có chứa > 5 % urê (tương đương với 12 % protein). Tráng rửa nắp và cổ bình bằng vài mililit nước. Thêm ≥ 2 g MgO (4.6), 5 mL dung dịch canxi clorua (4.5) và 3 mL dung dịch chất chống tạo bọt (4.1) và nối bình Kjeldah vào máy chưng cất Kjeldah. Chưng cất khoảng 100 mL vào bình có chứa dung dịch axit chuẩn (trong Phụ lục B) và chuẩn độ lượng axit dư bằng dung dịch kiềm chuẩn (trong Phụ lục A), sử dụng chỉ thị methyl đỏ (4.2).
8.2 Chuẩn độ mẫu trắng
Thực hiện tương tự như đối với phần mẫu thử nhưng thay phần dung dịch mẫu thử bằng cùng một thể tích nước cất 1 lần.
9 Tính kết quả
Hàm lượng nitơ tổng số của ure và amoniac, wN, bằng % khối lượng, được tính bằng công thức sau đây:
Trong đó:
| V0 | là thể tích của dung dịch chuẩn axit clohydric (4.8) được sử dụng trong phép xác định (8.1), tính bằng mililit (ml); |
| V1 | là thể tích của dung dịch chuẩn axit clohydric (4.8) được sử dụng trong phép thử trắng (8.2), tính bằng mililit (ml); |
| c | là nồng độ chính xác dung dịch chuẩn axit clohydric (4.8), tính bằng mol trên lít (mol/l); |
| m | là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g); |
| M | là khối lượng mol của nitơ, tính bằng gam trên mol (g/mol) (14,007). |
10 Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
c) phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy chọn cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng đến kết quả;
e) kết quả thử nghiệm thu được.
Phụ lục A
(Quy định)
Dung dịch chuẩn natri hydroxit
A.1 Thuốc thử
A.1.1 Nước không chứa cacbon dioxit
Chuẩn bị như sau: Đun sôi nước trong 20 min và để nguội với lớp bảo vệ bằng soda-lime.
A.1.2 Dung dịch natri hydroxit (1 + 1)
Cho 1 phần NaOH (chất lượng thuốc thử chứa < 5 % Na2CO3) vào bình, thêm 1 phần nước và lắc đều cho đến khi tan hoàn toàn. Đậy bình bằng nút cao su. Để yên cho đến khi Na2CO3 lắng xuống, để lại chất lỏng hoàn toàn trong suốt (khoảng 10 ngày).
A.1.3 Kali phthalate trong axit
Nghiền kali phthalate để lọt qua rây số 100. Sấy khô 2 h ở 120 °C. Làm nguội trong bình hút ẩm có chứa axit sulfuric.
A.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn kiềm
Bảng A.1 đưa ra các thể tích gần đúng của dung dịch NaOH (1 + 1) cần thiết để tạo ra 10 L dung dịch chuẩn.
Thêm thể tích dung dịch NaOH (1 + 1) cần dùng vào 10 L nước không chứa CO2. Kiểm tra nồng độ mol theo A.3 và điều chỉnh đến nồng độ mong muốn theo công thức sau:
V1 = V2 × M2/M1
Trong đó:
M2 và V2 lần lượt là nồng độ mol và thể tích dung dịch gốc
V1 là thể tích dung dịch gốc cần được pha loãng để có được nồng độ mol mong muốn M1.
Chuẩn hóa dung dịch cuối cùng như trong A.3.
Bảng A.1 - Thể tích dung dịch NaOH (1 + 1) cần thiết để pha các dung dịch có nồng độ mol khác nhau
| Nồng độ mol gần đúng | mL NaOH cần pha loãng đến 10 L |
| 0,01 | 5,4 |
| 0,02 | 10,8 |
| 0,10 | 54,0 |
| 0,50 | 270,0 |
| 1,0 | 540,0 |
A.3 Chuẩn hóa
Cân chính xác kali biphthalate (KHC8H4O4) đã làm khô vừa đủ để chuẩn độ khoảng 40 mL và chuyển vào bình 300 mL đã đuổi hết CO2. Thêm 50 mL nước nguội không chứa CO2. Đậy nắp bình và lắc nhẹ cho đến khi mẫu tan hết. Chuẩn độ đến pH 8,6 bằng dung dịch đã được chuẩn hóa, chú ý loại hết CO2 và sử dụng chất chỉ thị hoặc máy đo pH điện cực thủy tinh. Xác định thể tích NaOH cần thiết để tạo ra điểm kết thúc chuẩn độ mẫu trắng bằng cách so màu trong một bình khác chứa 3 giọt phenolphtalein và cùng thể tích nước không chứa CO2. Trừ thể tích cần thiết từ thể tích được sử dụng trong lần chuẩn độ đầu tiên và tính nồng độ mol.
Nồng độ mol (mol/L) = g KHC8H4O4 × 1000/mL NaOH × 204,299
Trong đó: 204,299 là khối lượng mol của kali biphthalate.
Phụ lục B
(Quy định)
Dung dịch chuẩn axit clohyric
B.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn
Bảng B.1 đưa ra các thể tích gần đúng của axit clohydric đặc 36,5 % đến 38 % cần thiết để chuẩn bị 10 L dung dịch chuẩn.
Bảng B.1 - Thể tích dung dịch axit clohydric đặc cần thiết để pha các dung dịch có nồng độ mol khác nhau
| Nồng độ mol gần đúng | mL axit clohydric cần pha loãng đến 10 L |
| 0,01 | 8,6 |
| 0,02 | 17,2 |
| 0,10 | 86,0 |
| 0,50 | 430,1 |
| 1,0 | 860,1 |
B.2 Phương pháp dùng dung dịch chuẩn natri hydroxit
Chuẩn độ 40 mL dựa vào dung dịch chuẩn kiềm natri hydroxit trong Phụ lục A có nồng độ tương tự như axit được chuẩn hóa trong bình cầu 300 mL đã đuổi hết CO2, sử dụng nước không chứa CO2 và 3 giọt phenolphtalein.
Nồng độ mol = (số ml chuẩn kiềm × nồng độ mol của kiềm)/số mL axit clohydric
Nếu nồng độ quá đặc thì pha loãng dung dịch đến giá trị yêu cầu theo Công thức sau:
V1 = V2 × M2/M1
Trong đó:
M2 và V2 là nồng độ mol và thể tích dung dịch gốc
V1 là thể tích dung dịch gốc cần được pha loãng để có được nồng độ mol mong muốn M1.
Kiểm tra nồng độ chính xác của dung dịch cuối cùng bằng cách chuẩn độ như trên. Nồng độ mol chỉ chính xác nếu sử dụng cùng một chất chỉ thị để xác định như trong phần chuẩn hóa. Chuẩn hóa lại nếu sử dụng các chất chỉ thị khác ngoài phenolphtalein.
Thư mục tài liệu tham khảo
[1] TCVN 4325 (ISO 6497) Thức ăn chăn nuôi-Lấy mẫu
[2] AOAC 941.04 Urea and Ammoniacal Nitrogen in Animal Feed. Urease Method
- 1 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13842-3:2023 (ISO/TS 20224-3:2020) về Phân tích dấu ấn sinh học phân tử - Phát hiện nguyên liệu có nguồn gốc từ động vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi bằng real-time PCR - Phần 3: Phương pháp phát hiện ADN của lợn
- 2 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13842-2:2023 (ISO/TS 20224-2:2020) về Phân tích dấu ấn sinh học phân tử - Phát hiện nguyên liệu có nguồn gốc từ động vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi bằng real-time PCR - Phần 2: Phương pháp phát hiện ADN của cừu
- 3 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9474:2024 (ISO 5985:2002, Amd 1:2015) về Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng tro không tan trong axit clohydric
- 4 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 14244:2024 về Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng nitơ nitrat và nitơ nitrit - Phương pháp đo màu
- 5 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 14355:2025 về Thức ăn chăn nuôi - Xác định asen vô cơ bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử với kỹ thuật hydrua hóa (HG-AAS) sau khi phân hủy bằng vi sóng và tách bằng cột chiết pha rắn (SPE)
- 1 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002) về thức ăn chăn nuôi - Lấy mẫu
- 2 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 6952:2018 (ISO 6498:2012) về Thức ăn chăn nuôi - Hướng dẫn chuẩn bị mẫu thử
- 3 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13842-3:2023 (ISO/TS 20224-3:2020) về Phân tích dấu ấn sinh học phân tử - Phát hiện nguyên liệu có nguồn gốc từ động vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi bằng real-time PCR - Phần 3: Phương pháp phát hiện ADN của lợn
- 4 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 13842-2:2023 (ISO/TS 20224-2:2020) về Phân tích dấu ấn sinh học phân tử - Phát hiện nguyên liệu có nguồn gốc từ động vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi bằng real-time PCR - Phần 2: Phương pháp phát hiện ADN của cừu
- 5 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9474:2024 (ISO 5985:2002, Amd 1:2015) về Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng tro không tan trong axit clohydric
- 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 14244:2024 về Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng nitơ nitrat và nitơ nitrit - Phương pháp đo màu
- 7 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 14355:2025 về Thức ăn chăn nuôi - Xác định asen vô cơ bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử với kỹ thuật hydrua hóa (HG-AAS) sau khi phân hủy bằng vi sóng và tách bằng cột chiết pha rắn (SPE)