Giới thiệu chung về Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 5166:1990
Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 5166:1990 quy định phương pháp xác định tổng số bào tử nấm men và nấm mốc trong các sản phẩm thực phẩm. Đây là văn bản kỹ thuật nền tảng giúp các phòng kiểm nghiệm, cơ quan quản lý và doanh nghiệp sản xuất đánh giá chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, kiểm soát mức độ ô nhiễm vi sinh vật trong suốt chuỗi sản xuất, chế biến và bảo quản.
Phân tích chi tiết nội dung từ Điều 1 đến Điều 4 của TCVN 5166:1990:
- Điều 1: Phạm vi áp dụng
- Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng nấm men và nấm mốc có khả năng phát triển trong các sản phẩm thực phẩm bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc sau khi nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp.
- Phương pháp này được áp dụng rộng rãi cho hầu hết các loại thực phẩm, nông sản, nguyên liệu chế biến và thức ăn chăn nuôi. Đối với các sản phẩm có tính chất đặc thù hoặc có độ hoạt động của nước thấp, có thể áp dụng các quy trình kiểm nghiệm chuyên biệt khác phù hợp hơn.
- Điều 2: Tiêu chuẩn viện dẫn
- Để áp dụng tiêu chuẩn này một cách chính xác, người thực hiện cần phối hợp sử dụng các tiêu chuẩn liên quan về lấy mẫu thực phẩm, chuẩn bị mẫu thử và các hướng dẫn chung về phân tích vi sinh vật.
- Các văn bản viện dẫn bao gồm các tiêu chuẩn quốc gia về phương pháp lấy mẫu nông sản thực phẩm, phương pháp pha loãng mẫu và các quy định chung về an toàn sinh học trong phòng thí nghiệm vi sinh vật học.
- Điều 3: Nguyên tắc của phương pháp
- Phương pháp dựa trên việc cấy một lượng mẫu thử xác định (hoặc các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu) vào môi trường nuôi cấy đặc hiệu chọn lọc.
- Sử dụng các chất ức chế sự phát triển của vi khuẩn (như kháng sinh chloramphenicol, chlortetracycline hoặc điều chỉnh pH bằng axit lactic) để tạo điều kiện tối ưu cho nấm men và nấm mốc phát triển mà không bị vi khuẩn cạnh tranh.
- Tiến hành ủ ấm các đĩa cấy trong điều kiện hiếu khí ở nhiệt độ từ 25 độ C đến 30 độ C trong khoảng thời gian từ 3 đến 5 ngày để các bào tử và tế bào nấm men, nấm mốc phát triển thành các khuẩn lạc có thể nhìn thấy bằng mắt thường.
- Tính toán số lượng nấm men và nấm mốc trên mỗi gam hoặc mỗi mililít mẫu thử ban đầu dựa trên số lượng khuẩn lạc đặc trưng đếm được trên các đĩa chọn lọc ở các độ pha loãng thích hợp.
- Điều 4: Thiết bị, dụng cụ và môi trường nuôi cấy
- Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm: Yêu cầu sử dụng các thiết bị đạt chuẩn kỹ thuật phòng thí nghiệm vi sinh bao gồm tủ ấm có khả năng duy trì nhiệt độ ổn định ở 25 - 30 độ C, nồi hấp tiệt trùng (autoclave), máy đo pH, máy dập mẫu hoặc máy lắc trộn, pipet vô trùng, đĩa Petri vô trùng, và các dụng cụ thủy tinh chuyên dụng khác.
- Môi trường nuôi cấy và chất pha loãng: Sử dụng các môi trường thạch chọn lọc phổ biến như thạch Sabouraud, thạch chiết xuất mạch nha (Malt Extract Agar) hoặc thạch khoai tây đường (Potato Dextrose Agar - PDA).
- Chất ức chế vi khuẩn: Bổ sung các loại kháng sinh bền với nhiệt hoặc bổ sung dung dịch axit lactic vô trùng để điều chỉnh pH của môi trường xuống mức axit (khoảng 3.5 đến 4.5), giúp ngăn chặn tối đa sự phát triển của các loài vi khuẩn đồng hành trong mẫu thực phẩm.
- Dung dịch pha loãng: Sử dụng nước peptone muối sinh lý vô trùng hoặc dung dịch đệm phosphat để chuẩn bị các nồng độ pha loãng của mẫu thử, đảm bảo không gây sốc thẩm thấu hoặc làm chết các tế bào nấm men và bào tử nấm mốc trong quá trình thao tác.
Lưu ý: Việc tuân thủ nghiêm ngặt các quy định kỹ thuật từ Điều 1 đến Điều 4 của TCVN 5166:1990 là điều kiện tiên quyết để đảm bảo tính chính xác, độ lặp lại và độ tái lập của kết quả thử nghiệm vi sinh vật trong thực phẩm.
TIÊU CHUẨN VIỆT NAM
TCVN 5166 - 1990
SẢN PHẨM THỰC PHẨM - PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ BÀO TỬ, NẤM MEN, NẤM MỐC
Foods - Method for enumeration of total yeasts and moulds
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp đếm tổng số bào tử nấm men, nấm mốc trong các loại sản phẩm thực phẩm.
1. NGUYÊN TẮC
Sử dụng kỹ thuật đổ đĩa, đếm khóm nấm trên môi trường thạch sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 28 ± 1°C trong thời gian từ 5 đến 7 ngày. Số lượng bào tử nấm men, nấm mốc trong 1g hoặc 1 ml mẫu sản phẩm thực phẩm kiểm nghiệm được tính từ số khóm nấm đếm được từ các đĩa nuôi cấy theo các đậm độ pha loãng.
2. LẤY MẪU VÀ CHUẨN BỊ MẪU
Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu theo TCVN 4886-89.
Lượng mẫu cân tối thiểu để pha loãng không ít hơn 1 ml đối với các sản phẩm khác.
3. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ
- Đĩa petri thủy tinh đường kính 90-100mm;
- pipet có chia độ loại 1, 5, 10 ml đã tiệt khuẩn;
- nồi cách thủy điều chỉnh được nhiệt độ 45 ± 1°C;
- tủ ấm điều chỉnh được nhiệt độ 30 ± 1°C;
- tủ sấy khô;
- nồi hấp áp lực;
- bình thủy tinh dung tích 250-500ml;
- ống nghiệm loại 16-160mm và lớn hơn;
- pH mét hoặc giấy đo pH.
4. HÓA CHẤT, MÔI TRƯỜNG
4.1. Hóa chất:
- Thạch dùng cho vi sinh vật;
- pepton dùng cho vi sinh vật;
- natri clorua tinh khiết (NaCl);
- glucoza tinh khiết;
- natri hydrophotphat tinh khiết (Na2HPO4);
- kali dihydrophotphat tinh khiết (KH2PO4);
- axit lactic, dung dịch 20% hoặc 30%;
- axit citric, dung dịch 20%;
- natri hydroxit tinh khiết (NaOH), dung dịch 0,1N.
4.2. Môi trường
a) Nước đệm pepton
Pepton 10g
NaCl 5g
Na2HPO4 9g
KH2PO4 1,5g
Nước cất 1000ml
b) Nước pepton
Pepton 1g
NaCl 8,5g
Nước cất 1000ml
c) Nước pepton có thạch
Nước đệm pepton (a) hoặc nước pepton (b) 1000ml
Thạch 1g
Pha chế môi trường a, b, c như sau: Đun nhỏ lửa, quấy đều để hòa tan các chất đến khi sôi. Để nguội đến 30 ± 1˚C, điều chỉnh pH môi trường bằng dung dịch NaOH 0,1 N sao cho khi tiệt khuẩn pH = 7,0 ± 0,2. Rót vào các bình dung tích 250ml mỗi bình 90ml, vào các ống nghiệm mỗi ống 9ml môi trường. Tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt độ 120 °C trong 15 phút.
Các môi trường trên cần được bảo quản ở nơi khô ráo, trong bóng tối với nhiệt độ từ 0 đến 5 °C không quá 30 ngày.
c) Môi trường thạch Sabouraud
Pepton 10g
Glucoza 20g
Thạch 15 - 20g
Nước cất 1000ml
Cách pha chế: Đun nhỏ lửa, quấy đều để hòa tan các chất đến khi sôi. Rót vào bình dung tích 250ml lượng môi trường 150ml. Tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt độ 110 °C trong 30 phút.
Nếu môi trường sử dụng ngay, để nguội đến 45 ± 1°C ở nồi cách thủy, nếu chưa sử dụng ngay thì cần bảo quản ở nơi khô ráo, trong bóng tối với nhiệt độ từ 0 đến 5°C không quá 30 ngày.
5. CÁC BƯỚC NUÔI CẤY
5.1. Pha loãng mẫu
Pha loãng mẫu theo TCVN 4887-89.
Chọn môi trường pha loãng: Sử dụng nước pepton hoặc nước đệm pepton nếu chỉ cần tính tổng số bào tử nấm men: sử dụng nước thạch hoặc nước pepton có thạch nếu cần tính tổng số cả nấm men và nấm mốc hoặc chỉ có nấm mốc.
Pha loãng mẫu cho đến khi có được đậm độ pha loãng cần thiết đếm được số khóm nấm trên đĩa theo dự tính.
5.2. Đổ đĩa
Đối với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ, mỗi đậm độ dùng 2 đĩa petri và 1 pipet đã tiệt khuẩn riêng.
Lấy 1ml sản phẩm hoặc dung dịch pha loãng ở những đậm độ khác nhau cho vào giữa từng đĩa petri.
Thạch đã đun nóng chảy, để nguội đến 45 ± 1°C, trong điều kiện vô khuẩn điều chỉnh pH môi trường thạch đến 4,5 - 5,5 bằng dung dịch axit lactic 20%, 40% hoặc dung dịch axit nitric 20%.
Rót vào từng đĩa 12 - 15ml môi trường thạch trên, đảo đều dung dịch mẫu với môi trường bằng cách lắc sang phải và sang trái mỗi chiều 3 lần.
Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng ngang.
Thời gian từ khi bắt đầu pha loãng đến khi rót môi trường vào đĩa không được quá 30 phút.
5.3. Ủ ấm
Khi thạch đã đông, để các đĩa đã nuôi cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 28 ± 1°C hoặc nhiệt độ phòng thí nghiệm tương ứng trong 5 - 7 ngày. Không lật ngược đĩa.
Sau 3 ngày, đếm kết quả sơ bộ, đếm tổng số các khóm nấm men và nấm mốc mọc trên các đĩa. (Chú ý nhẹ tay, không di chuyển mạnh tay hay lật ngược đĩa).
6. TÍNH KẾT QUẢ
Chọn tất cả các đĩa có không quá 150 khóm nấm để tính kết quả. Sự phân bố các khóm nấm trên các đĩa phải hợp lý, độ pha loãng càng cao thì số khóm nấm càng ít. Nếu kết quả không hợp lý, phải tiến hành lại các bước nuôi cấy. Tính kết quả như sau:
6.1. Chọn những đĩa có số khóm nấm men từ 15 đến 150, số khóm nấm mốc từ 5 đến 50 của 2 đậm độ pha loãng liên tiếp. Nếu chênh lệch các giá trị ở 3 đậm độ nhỏ hơn hoặc bằng 2 lần, tính số (N) bào tử cho 1 g hoặc 1 ml sản phẩm bằng cách tính trung bình cộng của tổng số khóm nấm đếm được trên các đĩa theo công thức sau:
| N = | Σ C |
|
| (n1 + 0,1 . n2) . d |
|
C: Số khóm nấm men hoặc nấm mốc đếm được trên các đĩa đã chọn.
n1, n2: Số đĩa ở 2 đậm độ liên tiếp đã chọn thứ 1, thứ 2.
d: Hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng đã chọn thứ 1.
Làm tròn số kết quả có được, chỉ giữ lại 2 số có nghĩa.
Biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10n (n là số mũ thích hợp của 10).
6.2. Nếu chênh lệch các giá trị ở 2 đậm độ lớn hơn 2 lần, lấy giá trị của đậm độ pha loãng thấp hơn để tính kết quả.
6.3. Nếu 2 đĩa của sản phẩm lỏng nguyên chất hoặc đậm độ pha loãng ban đầu có ít hơn 15 khóm nấm men hoặc ít hơn 5 khóm nấm mốc, tính kết quả theo trung bình cộng của các khóm nấm đã đếm được ở cả 2 đĩa tính ra cho 1 g hoặc 1 ml sản phẩm.
6.4. Nếu tất cả các đĩa không có khóm nấm nào mọc, đánh giá kết quả như sau:
- Ít hơn 1 bào tử nấm men, nấm mốc trong 1 ml sản phẩm.
- Ít hơn 
bào tử nấm men, nấm mốc trong 1g sản phẩm.
d: Hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng ban đầu (10-1).
7. BÁO CÁO KẾT QUẢ
Trong báo cáo kết quả kiểm nghiệm phải nêu phương pháp đã dùng và kết quả tính được: số bào tử nấm men, nấm mốc có trong 1 g hoặc 1 ml sản phẩm kiểm tra.
Sai lệch của phương pháp: Trong 95% trường hợp, sai lệch giới hạn của phương pháp từ 12 đến 37%.
- 1 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4886:1989 (ST SEV 3013 – 81) về sản phẩm thực phẩm và gia vị - trình tự lấy mẫu để phân tích vi sinh vật
- 2 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4887:1989 (ST SEV 3014 - 1981) về sản phẩm thực phẩm và gia vị - Chuẩn bị mẫu để phân tích vi sinh vật do Ủy ban Khoa học và Kỹ thuật Nhà nước ban hành
- 1 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5604:1991 (ST SEV 4710 - 84) về sản phẩm thực phẩm và gia vị - điều kiện chung để tiến hành đánh giá cảm quan do Ủy ban Khoa học Nhà nước ban hành
- 2 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8133-2:2011 (ISO/TS 16634-2 : 2009) về sản phẩm thực phẩm - Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng cách đốt cháy theo nguyên tắc dumas và tính hàm lượng protein thô - Phần 2: Ngũ cốc, đậu đỗ và sản phẩm ngũ cốc nghiền
- 3 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10918:2015 (CODEX STAN 39-1981) về Nấm khô
- 1 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4886:1989 (ST SEV 3013 – 81) về sản phẩm thực phẩm và gia vị - trình tự lấy mẫu để phân tích vi sinh vật
- 2 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5604:1991 (ST SEV 4710 - 84) về sản phẩm thực phẩm và gia vị - điều kiện chung để tiến hành đánh giá cảm quan do Ủy ban Khoa học Nhà nước ban hành
- 3 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4887:1989 (ST SEV 3014 - 1981) về sản phẩm thực phẩm và gia vị - Chuẩn bị mẫu để phân tích vi sinh vật do Ủy ban Khoa học và Kỹ thuật Nhà nước ban hành
- 4 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8133-2:2011 (ISO/TS 16634-2 : 2009) về sản phẩm thực phẩm - Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng cách đốt cháy theo nguyên tắc dumas và tính hàm lượng protein thô - Phần 2: Ngũ cốc, đậu đỗ và sản phẩm ngũ cốc nghiền
- 5 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10918:2015 (CODEX STAN 39-1981) về Nấm khô