TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8400-19:2014

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 19: BỆNH PHÓ THƯƠNG HÀN LỢN

Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 19: Salmonellosis in pig

Lời nói đầu

TCVN 8400-19:2014 do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương - Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 19: BỆNH PHÓ THƯƠNG HÀN LỢN

Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 19: Salmonellosis in pig

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh phó thương hàn do vi khuẩn Salmonella gây ra ở lợn.

2. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

Bệnh phó thương hàn lợn (Salmonellosis in pig)

Là bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn Salmonella gây ra với các thể bệnh chủ yếu là bại huyết do Salmonella choleraesuis (S. choleraesuis) chủng Kunzendorf và viêm ruột do Salmonella typhimurium (S. typhimurium).

Ngoài ra, Salmonella typhisuis (S. typhisuis), Salmonella enteritidis (S. enteritidis), Salmonella dublin (S. dublin), Salmonella derby (S. derby), Salmonella heidelberg (S. heidelberg) cũng có thể gây bệnh nhưng bệnh thường biểu hiện thoáng qua hoặc ở dạng nhiễm khuẩn cục bộ như viêm phổi, viêm màng não, ỉa chảy, hoặc viêm hạch lâm ba.

Đặc biệt các chủng S. typhimurium, S. enteritidis có khả năng gây bệnh trên người.

Vi khuẩn Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae, là vi khuẩn gram âm, có khả năng di động, hiếu khí hoặc yếm khí tùy tiện và không hình thành nha bào. Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, chủ yếu là kháng nguyên thân O (kháng nguyên O), kháng nguyên lông H (kháng nguyên H). Vi khuẩn Salmonella được chia thành các nhóm và các typ huyết thanh. Hiện nay đã phát hiện được trên 2400 typ huyết thanh.

3. Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng, trừ khi có quy định khác.

3.1. Môi trường thạch máu: Thạch máu cơ bản được bổ sung từ 5 % đến 7 % máu cừu, máu bê, hoặc máu thỏ (pha chế thạch theo hướng dẫn của nhà sản xuất).

3.2. Môi trường nước thịt

3.3. Thạch MacConkey hay thạch Brilliant green (BG) hoặc môi trường thạch XLD (xylose-lysine-deoxycholate agar).

3.4. Nước peptone (peptone water).

3.5. Bộ kháng huyết thanh chuẩn đơn giá và đa giá định typ kháng nguyên vi khuẩn Salmonella.

3.6. Nguyên liệu hóa chất cho các phản ứng sinh hóa (Phụ lục A).

3.7. Nguyên liệu cho PCR (Phụ lục B).

3.8. Môi trường tetrathionate

4. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm sinh học và một số thiết bị, dụng cụ cụ thể như sau:

4.1. Tủ ấm, duy trì nhiệt độ 37 °C.

4.2. Tủ ấm, duy trì nhiệt độ 42 °C.

4.3. Nồi hấp, duy trì ở nhiệt độ 115°C, 121 °C.

4.4. Phiến kính, sạch.

4.5. Que cấy, vô trùng.

4.6. Ống nghiệm, sạch, vô trùng

4.7. Màng lọc, có kích thước lỗ lọc 0,45 μm.

4.8. Que cấy chích sâu, vô trùng.

5. Cách tiến hành

5.1. Chẩn đoán lâm sàng

5.1.1. Đặc điểm dịch tễ

- Bệnh xảy ra chủ yếu ở lợn con sau cai sữa.

- Lợn khỏe có thể mang mầm bệnh và vi khuẩn thường cư trú tại hạch amidan và các tổ chức lâm ba

- Nguồn lây nhiễm chủ yếu là qua phân của lợn bệnh và lợn mang mầm bệnh.

- Bệnh có tính chất lây lan cục bộ địa phương.

5.1.2. Triệu chứng lâm sàng

Thể bại huyết

- Thể bệnh này thường gặp ở lợn con cai sữa dưới 2 tháng tuổi.

- Dấu hiệu đầu tiên của bệnh là lợn ủ rũ, bỏ ăn, nằm rúc đầu vào góc chuồng, một vài lợn chết có biểu hiện tím tái ở bốn chân và vùng bụng.

- Lợn sốt cao từ 40,5 °C đến 41,5 °C.

- Ho nhẹ, khó thở.

- Tỷ lệ chết cao.

- Lợn trưởng thành khi mắc thể bệnh này thường chết đột ngột hoặc sảy thai.

Thể viêm ruột

- Thể bệnh này thường gặp ở lợn con từ cai sữa đến 4 tháng tuổi.

- Lợn ỉa chảy phân loãng màu vàng có khi dính máu, màng nhày và fibrin, có thể bị đi bị lại vài lần và kéo dài đến vài tuần.

- Lợn mất nước, gầy, sốt từng cơn.

- Tỉ lệ chết thấp và chỉ xảy ra sau khi đi ỉa chảy vài tuần, còn phần lớn các lợn có thể hồi phục và trở thành vật mang trùng.

5.1.3. Bệnh tích đại thể

Thể bại huyết

- Tím tái ở tai, chân, đuôi, bụng.

- Lách, hạch màng treo ruột sưng to.

- Gan có các điểm hoại tử nhỏ.

- Phổi xung huyết, xuất huyết.

- Có khi có xuất huyết điểm ở miền vỏ thận, hoại tử ở ruột non.

Thể viêm ruột

- Tổn thương chủ yếu là hoại tử điểm hay tràn lan ở ruột già (kết tràng hoặc manh tràng). Hoại tử có khi có dạng loét cúc áo.

- Niêm mạc ruột dày lên phủ dịch nhày màu đỏ có những mảnh màu vàng xám.

- Hạch màng treo ruột và đặc biệt là hạch hồi mang tràng sưng to.

5.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

5.2.1. Lấy mẫu

Lợn chết nghi mắc bệnh thể bại huyết lấy bệnh phẩm là: máu, lách, gan, phổi. Mỗi loại bệnh phẩm được lấy vô trùng từ 50 g đến 100 g.

Lợn chết nghi mắc bệnh thể viêm ruột lấy bệnh phẩm là ruột hoặc chất chứa ruột vùng hồi tràng, hạch lympho vùng hồi manh tràng.

Lợn sống: lấy mẫu là phân trực tràng (lấy khoảng 10 g), dịch ngoáy họng vùng amidan.

Cho mỗi loại bệnh phẩm vào từng lọ hay túi ni lon vô trùng riêng biệt, đậy kín, bảo quản trong điều kiện lạnh từ 2 °C đến 8 °C và gửi về phòng thí nghiệm chậm nhất 24 h sau khi lấy mẫu.

Gửi kèm theo bệnh phẩm giấy yêu cầu xét nghiệm có ghi rõ triệu chứng, bệnh tích và đặc điểm dịch tễ.

5.2.2. Phân lập vi khuẩn

Bệnh phẩm được cấy vào các môi trường: môi trường nước thịt (xem 3.2), môi trường thạch máu (xem 3.1), môi trường chọn lọc (thạch MacConkey, thạch Brillian green, thạch XLD (xem 3.3)), nuôi cấy hiếu khí trong tủ ấm ở 37 °C (xem 4.1) trong 24 h.

Với những bệnh phẩm là phân, dịch ruột, dịch ngoáy họng hoặc bệnh phẩm phủ tạng nghi bị nhiễm tạp khuẩn, cấy vào môi trường tăng sinh như môi trường tetrathionate (xem 3.8), nuôi cấy hiếu khí trong tủ ấm ở 42 °C (xem 4.2) từ 36 h đến 48 h. Sau đó cấy chuyển vào môi trường thông thường và môi trường chọn Iọc.

Sau 24 h nuôi cấy, hình thái khuẩn lạc Salmonella trên các môi trường phân lập như sau:

Trên môi trường thạch máu (xem 3.1): khuẩn lạc có hình tròn, trơn, mặt vồng và màu trắng hơi đục.

Trên môi trường thạch MacConkey (xem 3.3): khuẩn lạc có hình tròn, trơn, hình vòm màu trắng hơi đục.

Trên môi trường thạch Brillian green (xem 3.3): khuẩn lạc có hình tròn, trơn, màu hồng đậm.

Trên môi trường thạch XLD (xem 3.3): khuẩn lạc có hình tròn, trơn, màu đỏ có nhân đen.

Chọn khuẩn lạc nghi ngờ cấy vào môi trường thạch máu (xem 3.1), nước peptone (xem 3.4) hoặc môi trường nước thịt (xem 3.2), nuôi trong tủ ấm (xem 4.1) từ 18 h đến 24 h để kiểm tra đặc tính sinh hóa hay giám định vi khuẩn bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) (xem Phụ lục B).

5.2.3. Xác định vi chuẩn

5.2.3.1. Kiểm tra các đặc tính sinh hóa

Bảng 1- Một số đặc tính sinh hóa đặc trưng của vi khuẩn Salmonella

Chú thích : Dương tính: ; Âm tính: -; Phản ứng thay đổi: (±)

Kiểm tra các đặc tính sinh hóa theo quy định tại Phụ lục A.

Có thể sử dụng kit sinh hóa thương mại để định danh vi khuẩn Salmonella spp theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

5.2.3.2. Xác định vi khuẩn Salmonella bằng phương pháp PCR

Có thể sử dụng phương pháp PCR để xác định vi khuẩn Salmonella với các cặp mồi đặc hiệu và chu trình nhiệt trình bày ở Bảng 2.

Bảng 2 - Các cặp mồi và chu trình nhiệt cho PCR

Tiến hành phản ứng PCR theo quy định tại Phụ lục B.

5.2.3.3. Định typ huyết thanh

Cấy vi khuẩn đã được xác định là Salmonella bằng xác định sinh hóa hay phương pháp PCR vào môi trường thạch máu (xem 3.1), nuôi trong tủ ấm (xem 4.1). Sau từ 18h đến 24h tiến hành định typ huyết thanh.

Định typ kháng nguyên theo nhóm và kháng nguyên O bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính (xem 4.4) với kháng huyết thanh chuẩn đa giá và đơn giá (xem 3.5). Các bước tiến hành phản ứng và đọc kết quả theo chỉ dẫn của nhà sản xuất kháng huyết thanh.

Định typ kháng nguyên H thường sử dụng phản ứng ngưng kết chậm trong ống nghiệm (xem 4.6). Các bước tiến hành phản ứng và đọc kết quả theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

Bảng 3 - Tính kháng nguyên của một số typ huyết thanh Salmonella

6. Kết luận

Lợn được xác định là mắc bệnh phó thương hàn khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích điển hình của bệnh và phân lập được vi khuẩn Salmonella trong phòng thí nghiệm thuộc các typ huyết thanh có khả năng gây bệnh cho lợn tại Bảng 3.

PHỤ LỤC A

(Quy định)

Phương pháp kiểm tra các đặc tính sinh hóa

A.1. Phản ứng sinh lndol

A.1.1. Thuốc thử Kovac’s

Thành phần

Paradimetylaminobenzaldehyde 5g

Cồn amylic                                75 ml

HCl đậm đặc                             25 ml

Cách pha: Hòa dung dịch paradimetylaminobenzaldehyde vào cồn amylic cho tan hết và để trong tủ tạnh 4 °C. Thêm từ từ 5ml đến 10 ml HCl hòa đều rồi để tủ lạnh, sau đó lại tiếp tục đổ HCl cho đủ lượng.

Bảo quản thuốc thử trong lọ tối màu, ở 4 °C.

A.1.2. Cách tiến hành

Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy vào môi trường nước peptone (xem 3.4) hoặc môi trường nước peptone (xem 3.4) có bổ sung tryptophan, nuôi trong tủ ấm (xem 4.1). Sau 24 h nuôi cấy, nhỏ từ 0,2 đến 0,3 ml dung dịch thuốc thử Kovac’s vào môi trường, lắc nhẹ.

Đọc kết quả như sau:

- Phản ứng dương tính: có vòng màu đỏ xuất hiện tại nơi tiếp giáp giữa thuốc thử và môi trường (sinh Indol).

- Phản ứng âm tính: không có vòng màu đỏ xuất hiện tại nơi tiếp giáp giữa thuốc thử và môi trường.

A.2. Sử dụng Citrate

Pha chế môi trường (thạch simon citrate) theo quy định của nhà sản xuất. Dùng que cấy (4.5) lấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy vào thạch simon citrate, nuôi trong tủ ấm (xem 4.1) từ 18 h đến 24 h. Vi khuẩn sử dụng citrate (dương tính) làm môi trường chuyển từ màu xanh lá cây sang màu xanh nước biển. Âm tính khi môi trường giữ nguyên màu xanh lá cây.

A.3. Đặc tính lên men đường glucose, lactose, sinh H₂S

Chuẩn bị môi trường TSI hoặc Kligler (theo hướng dẫn của nhà sản xuất).

Dùng que cấy chích sâu (xem 4.8) lấy chuẩn lạc nghi ngờ cấy thẳng (chính giữa phần thạch đứng) xuống đáy ống nghiệm chứa môi trường TSI hoặc Kligler, rút dần que cấy lên và tiếp tục cấy trên bề mặt nghiêng, nuôi trong tủ ấm (xem 4.1), sau 24 h kiểm tra.

Lên men đường lactoza:

- Dương tính: Mặt nghiêng màu vàng.

- Âm tính: Mặt nghiêng màu hồng.

Lên men đường glucose:

- Dương tính: Phần thạch đứng màu vàng.

- Âm tính: Phần thạch đứng màu hồng.

Khả năng sinh H₂S:

- Dương tính: Đáy ống nghiệm có màu đen.

- Âm tính: Đáy ống nghiệm không có màu đen.

A.4. Đặc tính phân hủy lysine

Sử dụng môi trường có lysine như môi trường lysine decarboxylase broth hoặc lysine- iron agar.

Sử dụng môi trường lysine- iron agar:

- Pha chế thạch nghiêng chế từ môi trường Lysine- iron agar theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy vào môi trường đã pha chế, nuôi trong tủ ấm (xem 4.1), sau từ 18 đến 24 h kiểm tra.

- Đọc kết quả: theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

Sử dụng môi trường canh thang lysine decarboxylase:

- Pha chế theo hướng dẫn của nhà sản xuất

- Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy vào môi trường đã pha chế, nuôi trong tủ ấm (xem 4.1), sau từ 18 đến 24 h kiểm tra.

- Đọc kết quả: theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

A.5. Lên men đường Manitol

Chuẩn bị môi trường

Pha nước peptone theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

Chuẩn bị chỉ thị màu andrade:

- Thành phần:

Axit fucsin        0, 5 g

Nước cất          100 ml

NaOH 1N          16 ml

- Cách pha chế: Nghiền fucsin, hòa vào nước cất cho tan hết. Cho từ từ lượng NaOH 1N, vừa cho vừa lắc đến khi chuyển màu từ đỏ tươi sang đỏ nâu, đến vàng úa, vàng thẫm thì dừng (thường từ 12 đến 17 ml). Để lắng từ 1 đến 2 h, lọc qua giấy lọc. Hấp tiệt trùng trong nồi hấp (xem 4.3) ở 120 °C trong 15 min

Cho 1 ml chỉ thị màu Andrade vào 100 ml nước peptone (xem 3.4), chia 4 ml vào mỗi ống nghiệm (xem 4.6). Hấp tiệt trùng trong nồi hấp (xem 4.3) ở 120 °C trong 30 min.

Chuẩn bị đường: pha đường thành dung dịch 10% (trong nước cất vô trùng), hấp tiệt trùng trong nồi hấp (xem 4.3) ở 110 °C từ 15 đến 20 min hoặc hấp cách quảng 3 lần 100 °C  trong 30 min hoặc lọc qua màng lọc (xem 4.7).

Pha môi trường nước pepton-đường: cho 0,3 ml dung dịch đường 10% vào ống nghiệm chứa 4ml nước pepton đã được hấp tiệt trùng.

Cách tiến hành

Dùng que cấy (xem 4.5) lấy khuẩn lạc nghi ngờ cấy vào các ống môi trường nước peptone-đường, nuôi trong tủ ấm (xem 4.1), sau 24 h đọc kết quả.

Đọc kết quả:

- Phản ứng dương tính: môi trường chuyển màu đỏ.

- Phản ứng âm tính: môi trường không đổi màu.

PHỤ LỤC B

(Quy định)

Phát hiện vi khuẩn Salmonella bằng phương pháp PCR

B.2. Chuẩn bị mẫu

Mẫu kiểm tra là vi khuẩn nghi là Salmonella đã nuôi cấy thuần khiết trên thạch máu nuôi trong tủ ấm (xem 4.1) từ 24 h đến 48 h.

Đối chứng dương: chủng vi khuẩn đã được giám định là Salmonella hoặc sử dụng các chủng Salmonella chuẩn.

B.3. Tách chiết DNA

Các vi chuẩn phân lập được từ mẫu bệnh phẩm và các mẫu đối chứng dương được tách chiết DNA bằng các kit thương mại hay bằng phương pháp sốc nhiệt. Nếu sử dụng kit thì các bước tiến hành theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

Tách chiết bằng phương pháp shock nhiệt: Lấy từ 3 khuẩn lạc đến 4 khuẩn lạc, hòa vào 100 μl nước vô trùng không chứa nuclease (nuclease free water). Đun sôi cách thủy trong 10 min rồi làm lạnh nhanh huyễn dịch trong đá 5 min. Ly tâm huyễn dịch với gia tốc 12 000 g trong 4 min. Thu hoạch phần nước trong phía trên để thực hiện phản ứng PCR.

B.4. Phản ứng PCR

Sử dụng cặp mồi ở Bảng 2 và chuẩn bị mồi ở nồng độ 20 μM. Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ống 0,2 ml. Thành phần cho 1 phản ứng (theo hướng dẫn của Kit Taq PCR master mix Kit-Qiagen) như sau:

Chu trình nhiệt trong Bảng 2.

Đối chứng dương: DNA tách chiết từ vi khuẩn Salmonella (xem B.2).

Đối chứng âm: gồm đầy đủ thành phần của một phản ứng PCR, nhưng không có DNA của vi khuẩn.

B.5. Chạy điện di

Sản phẩm PCR được chạy điện di trên thạch agarose từ 1,5 % đến 2 % trong dung dịch đệm TAE hoặc TBE.

Cho 2 μl dung dịch loading dye vào 8 μl sản phẩm PCR, trộn đều cho vào từng giếng trên bản thạch. Cho 10 μl thang chuẩn (marker) vào một giếng.

Bản thạch được điện di trong môi trường dung dịch đệm TAE hoặc TBE (tùy thuộc vào loại đệm sử dụng khi pha thạch), trong thời gian từ 30 min đến 40 min, ở 100 V, sau đó nhuộm bản thạch (sản phẩm PCR) bằng dung dịch ethidium bromide 0,2 mg/100 ml.

Có thể dùng chất nhuộm màu khác như SYBR green để nhuộm bản thạch (sản phẩm PCR) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất (ví dụ: SYBR safe DNA gel stain của Invitrogen).

B.6. Đọc kết quả

Phản ứng dương tính khi:

- Mẫu đối chứng dương: Có một vạch duy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm.

- Mẫu đối chứng âm: Không xuất hiện vạch.

- Mẫu kiểm tra: Có vạch giống mẫu đối chứng dương.

Phản ứng âm tính khi:

- Mẫu đối chứng dương: Có một vạch duy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm.

- Mẫu đối chứng âm: Không xuất hiện vạch.

- Mẫu kiểm tra: Không xuất hiện vạch.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] P.J.Quin, M.E.Cater, B. Markey, G.R.Cater, 1994. Clinical veterinary microbiology.

[2] JICA- Third edition, 2003. Standard Diagnostic Manual for livestock diseases in Thailand.

[3] Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Đỗ Ngọc Thúy. 2012. Bệnh phó thương hàn lợn - Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc. Trang 299 - 305

[4] Sổ tay bệnh dịch động vật. Copyright text Archie Hunter, 1994, 1996. Text Archie Hunter and SVSV project, 2000

[5] Schwartz, K.J., 1999. Salmonellosis. In: Straw, B.E., D'Allaire, S., Mengeling, W.L., Taylor, D.J. Diseases of Swine, Ames, USA: lowa State University Press, pp. 535-552

[6] Leigh A.Corner, Trevor J. Bagust, 1993. Australian Standard Diagnostic Technique for animal diseases. Standing committee agriculture and resource management.

[7] SALMONELLOSIS. Version adopted by the World Assembly of Delegates of the OIE in May 2010.

[8] Rahn K, De Grandis SA, Clarke RC, McEwen SA, Galán JE, Ginocchio C, Curtiss R 3rd, Gyles CL. 1992. Amplification of an invA gene sequence of Salmonella typhimurium by polymerase chain reaction as a specific method of detection of Salmonella. Mol Cell Probes. 6(4):271-9

[9] Oliveira SD, Rodenbusch CR, Cé MC, Rocha SL, Canal CW . 2003. Evaluation of selective and non-selective enrichment PCR procedures for Salmonella detection. Lett Appl Microbiol. 36(4):217-21.

[10] Akiba M, Kusumoto M, lwata T. 2011. Rapid identification of Salmonella entericaserovars, Typhimurium, Choleraesuis, Infantis, Hadar, Enteritidis, Dublin and Gallinarum, by multiplex PCR. J Microbiol Methods. 85(1):9-15