Giới thiệu chung về Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5164:1990
Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5164:1990 quy định phương pháp xác định hàm lượng Vitamin B1 (thiamin) trong lương thực và các sản phẩm chế biến từ lương thực. Đây là văn bản kỹ thuật quan trọng giúp thống nhất quy trình kiểm nghiệm, đánh giá chất lượng dinh dưỡng của các loại nông sản và thực phẩm chứa tinh bột tại Việt Nam. Dưới đây là tóm tắt chi tiết nội dung phần mở đầu và các điều khoản đầu tiên từ Điều 1 đến Điều 4 của tiêu chuẩn này.
Điều 1: Phạm vi áp dụng
Điều khoản này xác định rõ đối tượng và phạm vi hiệu lực của tiêu chuẩn:
- Tiêu chuẩn áp dụng cho các loại lương thực dạng hạt (như lúa, gạo, ngô, lúa mì) và các sản phẩm bột, sản phẩm chế biến từ lương thực.
- Quy định phương pháp huỳnh quang (phương pháp thiochrom) là phương pháp trọng tài để xác định hàm lượng Vitamin B1. Phương pháp này dựa trên nguyên lý oxy hóa thiamin trong môi trường kiềm thành thiochrom có khả năng phát huỳnh quang mạnh dưới ánh sáng tử ngoại.
Điều 2: Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu
Quy trình lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử đóng vai trò quyết định đến độ chính xác của kết quả phân tích:
- Việc lấy mẫu được thực hiện theo các tiêu chuẩn hiện hành về phương pháp lấy mẫu đối với từng loại lương thực cụ thể, đảm bảo mẫu mang tính đại diện cho cả lô hàng.
- Mẫu sau khi lấy về phải được bảo quản trong điều kiện tránh ánh sáng trực tiếp, tránh ẩm và nhiệt độ cao để ngăn ngừa sự phân hủy của Vitamin B1.
- Chuẩn bị mẫu thử: Tiến hành nghiền nhỏ mẫu đến độ mịn xác định, trộn đều và tiến hành cân ngay để phân tích hoặc bảo quản trong lọ thủy tinh màu tối có nút kín.
Điều 3: Hóa chất và thuốc thử
Để tiến hành thử nghiệm, các phòng thí nghiệm cần chuẩn bị đầy đủ các loại hóa chất và thuốc thử đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (TKPT):
- Axit clohydric (HCl): Dung dịch nồng độ 0,1 N và các nồng độ khác dùng để thủy phân liên kết của thiamin trong mẫu.
- Natri hydroxit (NaOH): Dung dịch kiềm dùng để điều chỉnh pH và tham gia vào phản ứng oxy hóa.
- Kali ferixianua (K3Fe(CN)6): Chất oxy hóa chính để chuyển thiamin thành thiochrom phát huỳnh quang.
- Rượu Isobutanol (hoặc n-Butanol): Dung môi hữu cơ dùng để chiết tách thiochrom ra khỏi hỗn hợp phản ứng.
- Chất chuẩn Vitamin B1 (Thiamin hydrochloride): Dùng để pha chế các dung dịch tiêu chuẩn phục vụ cho việc xây dựng đường chuẩn.
- Chế phẩm enzym (như Taka-diastase hoặc các enzym amylase, protease phù hợp): Sử dụng để giải phóng thiamin khỏi các dạng liên kết photphat hoặc liên kết protein trong thực phẩm.
- Nước cất: Sử dụng nước cất hoàn toàn không chứa các tạp chất gây ảnh hưởng đến phép đo huỳnh quang.
Điều 4: Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
Các thiết bị đo lường và dụng cụ thủy tinh sử dụng trong phương pháp này phải được hiệu chuẩn và đảm bảo độ chính xác cao:
- Máy đo huỳnh quang (Fluorometer): Thiết bị chuyên dụng có bước sóng kích thích và bước sóng đo phù hợp để đo cường độ huỳnh quang của thiochrom.
- Cân phân tích: Có độ chính xác đến 0,0001g để cân mẫu thử và chất chuẩn.
- Bể cách thủy hoặc tủ ấm: Có khả năng kiểm soát và duy trì nhiệt độ ổn định (thường từ 37 độ C đến 50 độ C) phục vụ quá trình thủy phân bằng enzym.
- Nồi hấp áp suất (Autoclave): Sử dụng cho quá trình thủy phân bằng axit ở nhiệt độ và áp suất cao.
- Hệ thống cột sắc ký trao đổi ion (nếu cần): Dùng để làm sạch và làm giàu mẫu trước khi tiến hành phản ứng oxy hóa.
- Dụng cụ thủy tinh phòng thí nghiệm: Bình định mức, pipet chính xác, phễu chiết, ống nghiệm thủy tinh tối màu để hạn chế tác động của ánh sáng lên Vitamin B1.
Đánh giá chung về các điều khoản đầu
Các quy định từ Điều 1 đến Điều 4 của TCVN 5164:1990 đã thiết lập một nền tảng kỹ thuật chặt chẽ và khoa học. Việc tuân thủ nghiêm ngặt các yêu cầu về hóa chất tinh khiết, thiết bị đo chuẩn xác và quy trình chuẩn bị mẫu không chỉ đảm bảo tính khách quan của kết quả kiểm nghiệm mà còn giúp các doanh nghiệp, cơ quan quản lý kiểm soát tốt chất lượng dinh dưỡng của lương thực lưu thông trên thị trường.
TIÊU CHUẨN VIỆT NAM
TCVN 5164:1990
LƯƠNG THỰC
PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG
VITAMIN B1 (THIAMIN)
Cereals
Method of Determination of Vitamin B1 content
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp huỳnh quang để xác định hàm lượng Vitamin B1.
1. Nguyên tắc
Vitamin B1 bị oxy hoá bởi kaly ferixyanua ở môi trường kiềm tạo thành thiocrom có huỳnh quang màu xanh da trời. Chiết thiocrom bằng isobutanol, đo mật độ huỳnh quang ở bước sóng thích hợp.
2. Lấy mẫu
Theo quy định về việc lấy mẫu đối với sản phẩm lương thực cụ thể
3. Hoá chất, dụng cụ và thiết bị
3.1. Hoá chất
- Natri axetat (TK.PT) dung dịch 2N: Hoà tan 15g natriaxetat ngậm nước vào nước cất và thêm nước cất vừa đủ 1 lít.
- Natri hydroxit (TK.PT) dung dịch 15%: Hoà tan 15g natri hydroxit trong nước và thêm nước cất vừa đủ 100 ml.
- Kali ferixyanua (TK.PT) dung dịch 1%: Hoà tan 1g kali ferixyanua trong nước cất và thêm nước cất vừa đủ 100 ml. Dung dịch pha chỉ dùng trong ngày.
- Chất oxy hoá: Hỗn hợp 4 ml dung dịch kali ferixyanua 1% với dung dịch natri hydroxit 15% đến vừa đủ 100 ml. Dung dịch pha dùng trong 4 giờ.
- Isobutanol (TK.PT)
- Vitamin B1 (TK.PT) dung dịch chuẩn: Cân khoảng 30-40mg với độ chính xác 0,0001 g thiamin clohydrat (đã làm khô trong bình hút ẩm) hoà tan trong bình định mức 1 lít bằng dung dịch cồn etylic 20% đã axit hoá bằng axit clohydric đến pH-3,5-4. Bảo quản ở nhiệt độ 100C tránh ánh sáng.
- Kali clorua hay natri clorua; TK.HH;
3.2. Dụng cụ và thiết bị:
- Cân phân tích, cân kỹ thuật;
- Tủ sấy;
- Bình định mức, dung tích 1 lít, 250 ml;
- Cốc có mỏ, dung tích 250 ml;
- ống đong chia độ, dung tích 5 ml, 100 ml;
- Nồi cách thuỷ;
- Phễu lọc thuỷ tinh, dung tích 250 ml;
- ống nghiệm nút mài, dung tích 40-50ml;
- Pipet có bầu, dung tích 1ml, 5ml;
- Máy đánh nghiền hoặc cối chày sứ;
- Máy lắc;
- pH met;
- Huỳnh quang kế.
4. Tiến hành thử
4.1. Chiết vitamin B1 ra khỏi mẫu lương thực:
Cân chính xác một lượng mẫu đã nghiền nhỏ trộn đều ước tính chứa khoảng 20-50mg thiamin cho vào cốc có mỏ dung tích 250ml. Tiến hành song song với dung dịch chuẩn bằng cách hút chính xác 1ml dung dịch chuẩn Vitamin B1 cho vào cốc khác. Thêm vào các cốc, mỗi cốc 100ml dung dịch HCl 0,1N (pH=1-1,5), đậy nắp, đun cách thuỷ sôi 45 phút hoặc đun trong nồi áp suất (t0=110-1200C) trong 35 phút (kể từ khi đạt nhiệt độ). Để nguội đến nhiệt độ phòng, điều chỉnh pH các cốc bằng dung dịch natri axetat 2N đến pH = 4 - 4,5. Chuyển toàn bộ dịch ở mỗi cốc sau khi điều chỉnh pH vào bình định mức 250ml và thêm nước cất đến vạch. Lọc dung dịch bằng giấy lọc không hấp phụ thiamin (hoặc giấy lọc không tro) bỏ vài mililit đầu.
4.2. Oxy hoá thiamin thành thiocrôm:
Với mỗi dung dịch mẫu định lượng, kể cả dung dịch chuẩn, được tiến hành song song trên 4 ống nghiệm nút mài dung tích 40-50ml. Trong mỗi ống chứa sẵn 3g kali clorua. Hút chính xác 5ml mỗi dịch lọc vào từng ống nghiệm trong 4 ống, hai ống được coi là ống trắng, hai ống được coi là ống thử của từng mẫu.
4.2.1. Đối với ống trắng của các mẫu được tiến hành như sau:
Lắc nhẹ ống nghiệm bằng máy lắc thêm ngay 3ml dung dịch natri hydroxit 15%, lắc trộn cho đều, thêm nhanh 15ml isobutanol, đậy ống, lắc mạnh trong 15 giây, để lắng.
4.2.2. Đối với các ống thử còn lại của các mẫu được tiến hành như sau:
Lắc ống nghiệm bằng máy lắc, thêm ngay 3ml dung dịch chất oxy hoá (dung dịch kiềm kaliferixyanua), lắc trộn đều, thêm nhanh 15ml isobutanol, đậy ống, lắc mạnh trong 15 giây, để lắng.
Các ống nghiệm trên để lắng cho tách lớp trong bóng tối trong vòng 20 phút. Sau đó hút hoặc gạn lấy khoảng 10ml dung dịch isobutanol có chứa huỳnh quang ở bên trên.
4.3. Đo huỳnh quang:
Đo mật độ huỳnh quang của dung dịch isobutanol bằng máy đo huỳnh quang tại bước sóng kích thích và phát xạ là 360 mm và 435 mm (đối với huỳnh quang kế Coleman thì dùng 2 kính lọc số 12.221 và 14.221 tương đương với 2 bước sóng trên).
5. Tính toán kết quả
Hàm lượng Vitamin B1 (X) tính bằng microgam trong 100g lương thực được tính theo công thức sau:
Trong đó:
Cc: Hàm lượng Vitamin B1 trong mẫu chuẩn (mg)
Dct: Mật độ huỳnh quang ống chuẩn thử
Dctr: Mật độ huỳnh quang ống chuẩn trắng
Dmt: Mật độ huỳnh quang ống mẫu thử
Dmtr: Mật độ huỳnh quang ống mẫu trắng
P: Khối lượng mẫu cân (g)
Mỗi mẫu lương thực được tiến hành phân tích trên hai phép xác định song song, kết quả phân tích ở hai phép xác định này không được sai lệch nhau quá 10%. Kết quả là trị số trung bình của hai phép xác định song song.