TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8710-4:2011

BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 4: BỆNH ĐẦU VÀNG Ở TÔM

Aquatic animal disease - Diagnostic procedure - Part 4: Yellow head disease

Lời nói đầu

TCVN 8710-4 : 2011 do Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Pháttriển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượngthẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

TCVN 8710-4:2011

BỆNH THỦY SẢN - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 4: BỆNH ĐẦU VÀNG Ở TÔM

Aquatic animal disease - Diagnostic procedure - Part 4: Yellow head disease

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh đầu vàng do vi rút trên tôm he.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫnghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 8378:2010, Tôm và sản phẩm tôm - Phát hiện virut gây bệnh đầu vàng (YHV) bằng kỹ thuậtphản ứng chuỗi trùng hợp-phiên mã ngược (RT-PCR).

3. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa nêu trong TCVN 8378:2010.

4. Phương pháp chẩn đoán

4.1 Chẩn đoán lâm sàng

4.1.1 Dịch tễ học

Bệnh xảy ra thành dịch chủ yếu ở tôm sú (Penaeus monodon) và tôm he chân trắng (P. vannamei). Tuy nhiên, một số loài tôm tự nhiên cũng có hiện tượng cảm nhiễm với bệnh như P. japonicus, P. merguiensis, P. stylirostris, P. setiferus, Metapenaeus ensis, Palaemon styliferus và Euphasia superba.

YHV có thể cảm nhiễm ở các giai đoạn phát triển khác nhau trong chu kì sống của tôm: tôm mẹ, tôm ấu trùng, hậu ấu trùng, tôm giống, tôm thịt. Nhưng bệnh thường xảy ra ở giai đoạn tôm giống từ 40 ngày đến 70 ngày tuổi. YHV có thể gây tỉ lệ chết đến 100 % trong vòng 3 ngày đến 5 ngày kể từ khi quan sát thấy dấu hiệu bệnh lý.

Phương thức lan truyền bệnh: Bệnh thường lây lan thông qua những vật trung gian bị nhiễm bệnh nhưPalaemon styliferus và Acetes sp, qua nguồn nước có chứa vi rút đến tôm nuôi. Bệnh cũng có thể lây lan theo những cá thể nhiễm bệnh mãn tính lan truyền sang con cháu trong quá trình sinh sản.

4.1.2 Triệu chứng lâm sàng

Tôm bị bệnh thường giảm ăn. Trong ngày thứ nhất, một số con lờ đờ hôn mê bới trên tầng mặt gần ao. 

Những con tôm này có phần đầu ngực màu vàng. Sang ngày thứ hai, số tôm bị bệnh tăng lên. Từ ngày thứ ba từ khi dừng ăn, hiện tượng chết bắt đầu và cuối cùng có thể chết 100 % sau 7 ngày đến 10 ngày.

Tôm bệnh thường bơi gần tầng mặt hoặc gần bờ. Gan tụy chuyển màu vàng nên nhìn giáp đầu ngựccó màu vàng nhạt, mang tôm bệnh có màu trắng, vàng nhạt hay nâu.

Trong một số trường hợp tôm không xuất hiện dấu hiệu bệnh lí nhưng quan sát các tế bào gan tụy, tếbào máu, cơ quan lympho, ruột, mang, tuyến an ten, mô liên kết thấy các thể vùi trong tế bào chất, nhân tế bào co rúm, trong một số trường hợp vỡ thành nhiều mảnh.

4.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

4.2.1 Phương pháp RT PCR, theo TCVN 8378:2010.

4.2.2 Phương pháp mô bệnh học

4.2.2.1 Lấy mẫu

Thu lấy mẫu tôm từ Postlarvae 5 đến tôm trưởng thành. Mẫu tôm phải còn sống hoặc đang trong tình trạng hấp hối.

Thu những mẫu tôm có biểu hiện bệnh có dấu hiệu không bình thường, có phần đầu ngực màu vàng, màu sắc cơ thể nhợt nhạt, mang tôm bệnh có màu trắng, vàng nhạt hay nâu.

Không dùng tôm đã chết hoặc tôm bảo quản lạnh để cắt mô.

4.2.2.2 Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hai lần đã khử ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

- Dung dịch Davidson (xem A.1).

- Thuốc nhuộm hematoxylin (xem A.2).

- Thuốc nhuộm eosin (xem A.3).

- Cồn 70 %, 80 %, 95 % và cồn tuyệt đối.

- Parafin

- Xylen

- Keo dán, ví dụ Bom Canada

4.2.2.3 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm chẩn đoán bệnh.

- Kính giải phẫu

- Bộ đồ giải phẫu gồm các dụng cụ panh, rùi nhọn, giải phẫu kéo các loại, lam kính và lamen

- Lọ nhỏ cố định mẫu.

- Bình rót parafin

- Bộ phận làm lạnh mẫu

- Máy cắt mẫu microtome

- Nồi nước có chỉnh nhiệt độ

- Tủ ấm hoặc bàn sấy mẫu

- Kính hiển vi quang học

- Cassete

- Khung đúc mẫu.

 4.2.2.4 Cách tiến hành

4.2.2.4.1 Chuẩn bị mẫu

Cố định mẫu trong dung dịch Davidson. Tỷ lệ mẫu và dung dịch cố định là 1/10.

Đối với tôm ấu trùng hoặc tôm postlavare (hậu ấu trùng) có thể cố định cả con trong dung dịch từ 12 h đến 24 h. Thu lấy khoảng từ 30 con đến 50 con trên bể. Sau đó cố định trong cồn 70 % ở nhiệt độ phòng.

Đối với tôm lớn lấy mang, dạ dày và biểu mô dưới vỏ cho vào lọ có chứa dung dịch Davidson. Thu lấy khoảng từ 5 con đến 10 con một ao. Ngâm trong 24 h đến 72 h phụ thuộc vào kích thước của mẫu, sau đó bảo quản ngay trong cồn 70 % ở nhiệt độ phòng.

4.2.2.4.2 Khử mẫu cố định

Ngâm trong cồn 90 % hai lần, trong thời gian 30 min đến 60 min mỗi lần. Sau đó ngâm trong cồn tuyệt đối hai lần, thời gian 30 min đến 60 min mỗi lần.

4.2.2.4.3 Làm trong mẫu

Ngâm sang xylen 1 để trong 30 min đến 60 min.

Ngâm sang xylen 2 để trong 30 min đến 60 min.

Ngâm tẩm parafin 2 lần, mỗi lần 56 ºC đến 58 ºC trong 1 h.

Đúc khuôn: Đặt mẫu đã thấm parafin vào khuôn đổ parafin tập trung vào một mặt của khuôn để khi cắt được tốt hơn. Làm lạnh mẫu trong bàn lạnh hoặc để trong tủ lạnh.

4.2.2.4.4 Cắt mẫu

Cắt gọt khối block parafin vuông, mặt cắt bằng phẳng, để trên mặt khay đá.

Đặt mặt khối block nến song song với mép lưỡi dao, cắt chiều dày lát cắt từ 4 µm đến 5 µm.

Chọn lát cắt tiêu bản phẳng thả vào nồi nước nhiệt độ nước từ 30 ºC đến 35 ºC; sau đó dùng lam kính vớt lát cắt tiêu bản. Để khô.

4.2.2.4.5 Nhuộm tiêu bản H&E

Tẩy parafin bằng cách ngâm trong xylen hai lần, mỗi lần từ 3 min đến 5 min, sau đó ngâm lần lượt trong cồn tuyệt đối, cồn 90 % và cồn 70 %, mỗi lần ngâm từ 3 min đến 5 min rồi đem rửa dưới vòi nước chảy từ 3 min đến 5 min.

 Ngâm trong thuốc nhuộm haematoxylin từ 3 min đến 5 min sau đó rửa dưới vòi chảy từ 3 min đến 5 min rồi tiếp tục ngâm trong thuốc nhuộm eosin từ 1 min đến 2 min.

Làm mất nước trong mẫu qua các thang nồng độ cồn 75 %, cồn 90 % và cồn tuyệt đối, mỗi bước từ 1 min đến 2 min, chuyển sang xylen hai lần (mỗi lần từ 2 min đến 3 min), gắn lamen bằng keo dán, ví dụ Bom Canada. Để khô và soi kính.

4.2.2.4.6 Đọc kết quả

Soi kính hiển vi từ vật kính có độ phóng đại thấp đến vật kính có độ phóng đại cao.

Khi tôm bị bệnh đầu vàng, kiểm tra mô bệnh học tế bào có hiện tượng hoại tử ở nhiều cơ quan và xuất hiện các thể vùi trong tế bào chất, nhân thoái hoá kết đặc bắt màu đậm và phân mảnh của nhiều tế bào khác nhau: hệ bạch huyết (lymphoid), tế bào mang, tế bào kẽ gan tụy, tế bào biểu bì ruột. Cơ quan tạo máu (haemolymphoid) có nhiều nhân tế bào thoái hóa kết đặc bắt màu đỏ đậm, kích thước khác nhau.

5. Kết luận

Tôm được xác định nhiễm bệnh vi rút đầu vàng khi có các đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng và kết quả dương tính thu được từ một trong hai phương pháp sau:

- Phản ứng PCR phát hiện vi rút dương tính;

- Mẫu cắt mô có bệnh tích của vi rút đầu vàng.

PHỤ LỤC A

(Quy định)

THÀNH PHẦN VÀ CHUẨN BỊ DUNG DỊCH THUỐC THỬ

A.1 Dung dịch Davidson

Cồn 95 %:                                                       330 ml

Formalin (formaldehyd 37 %):                        220 ml

Axit axetic đậm đặc:                                       115 ml

Nước:                                                             335 ml

A.2 Thuốc nhuộm hematoxylin (dung dịch hematoxylin - Mayer)

Hematoxylin dạng tinh thể:                             1 g

Natri iodat:                                                       0,2 g

Amoni alum [NH4Al(SO4)2] hoặc kali alum [KAl(SO4)2]: 50 g

Axit xitric:                                                        1 g

Cloral hydrat:                                                  50 g

Nước:                                                             1000 ml

Hoà tan hematoxylin trong nước, sau đó cho natri iodat và amoni alum hoặc kali alum, hoà tan, tiếp tục cho axit xitric và chloral hydrat rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.

A.3 Thuốc nhuộm eosin

Eosin Y:                                                           1 g

Cồn 70 %:                                                       1 lít

Axit axetic băng:                                             5 ml

Thêm từ 2 giọt đến 3 giọt axit axetic vào cồn 70 %. Hoà tan eosin trong cồn, sau đó cho thêm axit axetic rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Chainarong Wongteerasupayal, S.S., Joan E. Vickers, Anutara krajamorn krajamorn., Vichai Boonsaengl., Sakol Panyiml., Anchalee Tassanakajon., Boonsirm Withyachumnarnkul., Flegel. T. W. 1995. Yellow-head virus of Penaeus monodon is an RNA virus Dis. Aquat. Org. 22: p. 45-50.

[2] Chantanachookin, C., Boonyaratpalin, S., Kasornchandra, J., Sataporn, D., Ekpanithanpong, U., Supamataya, K., Sriurairatana, S., Flegel, T.W. 1993. Histology and ultrastructure reveal a new  granulomas-like virus in Penaeus monodon affected by yellow-head disease. Dis. Aquat. Org. 17: p. 145-157.

[3] FAO/NACA. 2001. Asia Diagnostic Guide to Aquatic Animal Diseases. FAO Fish. Pap. No.402/2: p. 237 pp.

[4] Lightner, D.V.E. 1996. A Handbook of Shrimp Pathology and Diagnostic Procedures for Diseases of Cultured Penaeid Shrimp. World Aquaculture Society: p. 305 pp.

[5] Limsuwan, C. 1991. Handbook for Cultivation of Black Tiger Prawns. Tamsetakit Co Ltd.

[6] Priyanjalie K.M. Wijegoonawardanea, Jeff A. Cowleya, Peter J.Walkera. 2008. Consensus RT- nested PCR detection of yellow head complex genotypes in penaeid shrimp. Journal of Virological Methods.

[7] OIE, 2009. Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals.

[8] Spann, K.M., Vickers, J.E., Lester, R.J.G. 1995. Lymphoid organ virus of Penaeus monodon from Australia. Dis. Aquat. Org. 23: p. 127-134.

[9] Spann, K.M., Cowley, J.A., Walker, P.J., Lester, R.J.G. 1997. A yellow-head-like virus from Penaeus monodon cultured in Australia. Dis. Aquat. Org. 31: p. 169-179.

[10] Walker, P.J., Flegel, T.W., Boonsaeng, V., Lightner, D.V., Tang, K., Loh, P.C., Chang, P.S.,Bonami, J.R., Cowley, J.A., Snijder, E., Enjuanes, L, Roniviridae. Fauquet, C.M., Mayo, M.A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L.A, 2004. Virus Taxonomy, Eighth Report of the ICTV. Elsevier/Academic Press,: p. 973-977.

[11] Walker, P.J., Cowley, J.A., Spann, K.M., Hodgson, R.A.J., Hall, M.R., Withyachumnarnkul, B., Yellow head complex viruses: transmission cycles and topographical distribution in the AsiaPacific region. Browdy, C.L., Jory, D.E., 2001. The NewWave: Proceedings of the Special Session on Sustainable Shrimp Farming: p. 227-237.

[12] Wongteerasupaya C., Boonsaeng V., Panyim S., Tassanakajon A., Withyachumnarnkul B. & Flegel T.W. 1997. Detection of yellow-head virus (YHV) of Penaeus monodon by RT-PCR amplification. Dis. Aquat. Org.,31, 181-186.