TIÊU CHUẨN NGÀNH

10 TCN 208:1995

PHÂN VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH NI TƠ

YÊU CẦU KỸ THUẬT, PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA, NHÃN, BAO BÌ ĐÓNG GÓI

Tiêu chuẩn này áp dụng cho việc xác định, kiểm tra phân vi sinh vật cố định ni tơ

1. Định nghĩa:

Phân vi sinh vật cố định ni tơ (Phân đạm vi sinh) là sản phẩm chứa một hoặc nhiều chủng vi sinh vật cố định nitơ (VSVCĐN) tồn tại trên nền chất mang thanh trùng hay không thanh trùng.

2. Tiêu chuẩn chất lượng:

2.1. Yêu cầu chung:

- Phân vi sinh vật cố định ni tơ phải có hiệu quả trên đồng ruộng như đã ghi trên nhãn giới thiệu, gồm cả mức tăng năng xuất nông phẩm hay tiết kiệm phân bón hữu cơ và vô cơ.

- Phân vi sinh vật cố định ni tơ không gây độc hại cho người, động vật, thực vật và môi trường sinh thái.

2.2. Yêu cầu kỹ thuật (chỉ tiêu chất lượng)

Các chỉ tiêu kỹ thuật của phân vi sinh vật cố định ni tơ phải phù hợp với các mức quy định trong các bảng quy định sau:

Bảng 1: Phân vi sinh vật cố định ni tơ trên nền chất mang thanh trùng

Bảng 2: Phân vi sinh cố định ni tơ trên nền chất mang không thanh trùng

3. Phương pháp kiểm tra:

3.1. Lấy mẫu:

Lấy ngẫu nhiên 10 gói, mỗi gói 25-30g hay 25-30ml đối với phân vi sinh vật cố định ni tơ trên nền chất mang thanh trùng hoặc 500-600g phân vi sinh vật cố định ni tơ trên nền chất mang không thanh trùng trong một đợt sản xuất của nhà máy hay các cửa hàng bán lẻ, trong đó 5 gói dùng để kiểm tra chất lượng hiện tại và 5 gói khác được bảo quản trong điều kiện bình thường dùng để kiểm tra chất lượng lúc cuối thời hạn sử dụng.

3.2. Kiểm tra:

3.2.1. Thiết bị dụng cụ kiểm tra:

- Bình tam giác 250ml.

- Ống nghiệm 15x 150mm, 18x 180mm.

- Pipét 1ml, 5ml, 10ml.

- Hộp lồng.

- Nồi hấp khử trùng, tủ sấy, tủ ấm.

- Buồng cấy vô trùng.

3.2.2. Chuẩn bị môi trường:

- Môi trường nuôi cấy VSVCĐN cộng sinh (môi trường YMA)

Manitol                                      10,0g

K₂HPO₄                                     0,5g

MgSO₄. 7H₂O                            0,2g

NaCl                                         0,lg

Cao nấm men                            1,0g

Nước cất vừa đủ                       l000ml

Thạch                                       20g

Congo đỏ 1%                             2,5ml

pH                                            6,8

- Môi trường nuôi cấy VSVCĐN hội sinh và tự do (môi trường Ashby)

Manitol                                      20,0g

K₂HPO₄                                     0,2g

MgSO₄. 7H₂O                            0,2g

NaCl                                         0,2g

K₂SO₄                                                                              0,1g

CaCO₃                                                                             5,0g

Nước cất vừa đủ                       1000ml

Thạch                                       20g

pH                                            6,5-7,0

- Môi trường Glucose peptone (môi trường GP)

Glucose                                    5,0g

Pepton                                      10,0g

Thạch                                       20,0g

Bromocresol 1% trong cồn          10,0ml

- Môi trường trồng cây chỉ thị (môi trường Jensen)

CaHPO₄                                    1,0g

K₂HPO₄                                                                          0,2g

MgSO₄.7H₂O                             0,2g

NaCl                                         0,2g

FeCl₃                                        0,1 g

Nước cất vừa đủ                       l000ml

Thạch                                       8,0g

Dung dịch vi lượng *                   1,0ml

pH                                            6,5-7,0

* Dung dịch vi lượng có thành phần như sau:

Bo^-: 0,05%                                Mn^-: 0,05%

Zn^-: 0,005%                               Mo^- : 0,05 %

Cu^-: 0,02%

Cân và hoà tan các thành phần môi trường trong nước theo thứ tự như trên. Phân môi trường vào các bình tam giác, làm nút bông đậy kín và đem khử trùng. Lấy ra để nguội tới nhiệt độ 40-45^oC rồi đổ vô trùng vào các hộp lồng đã khử trùng. Đối với môi trường trồng cây chỉ thị cũng làm như trên nhưng đổ môi trường vào các ống nghiệm 18 x 180mm (khoảng 1/3 ống). Làm nút bông và khử trùng như trên, sau đó lấy ra và đặt nghiêng ống thạch với góc 45^o.

3.2.3. Tiến hành kiểm tra:

3.2.3.1. Xác định mật độ vi sinh vật cố định ni tơ sống tự do và hội sinh:

Mật độ VSVCĐN sống tự do và hội sinh được xác định theo phương pháp cấy trên thạch đĩa với môi trường Ashby (Phương pháp Koch). Cách tiến hành như sau:

Cân 10 g hay 10 ml phân cho vào bình tam giác 250ml chứa 90ml nước cất vô trùng, vô đạm. Đậy kín nút bông rồi đưa lên máy lắc, lắc với tốc độ 200 vòng/ phút trong thời gian 15 phút. Sau đó dùng pipét vô trùng lấy lml dung dịch cho vào 1 ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng, vô đạm lắc, khuấy ống nghiệm để trộn đều dung dịch. Dùng pipét vô trùng khác lấy từ ống nghiệm này ra lml dung dịch và đưa vào ống nghiệm khác cũng chứa 9ml nước cất vô trùng, vô đạm như trên. Trộn đều hỗn hợp. Quá trình này được tiếp tục tiến hành đến ống nghiệm thứ 7. Từ ống nghiệm thứ 5, thứ 6 và thứ 7 lấy ra mỗi ống 3 giọt dung dịch (mỗi giọt tương đương với 0,04ml) cho vào 3 hộp lồng chứa môi trường thạch đã chuẩn bị sẵn, mỗi hộp lồng 1 giọt. Dùng que gạt thuỷ tinh vô trùng dàn đều dung dịch trên bề mặt đĩa thạch. Để hộp lồng vào tủ ấm ở nhiệt độ 28^oC và tiến hành nuôi trong thời gian 48 giờ. Sau thời gian nuôi cấy lấy hộp lồng ra và tiến hành đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch (chú ý chỉ đếm hộp lồng có chứa số khuẩn lạc từ 30-300).

Số lượng VSVCĐN được tính theo công thức sau:

N: Số lượng VSVCĐN/g hay ml

a: Số lượng khuẩn lạc trung bình/ hộp lồng

n: Số thứ tự ống nghiệm pha loãng

* Đối với loại phân vi sinh vật cố định ni tơ dạng tiềm sinh trước tiên cần hoạt hoá tế bào trong môi trường Ashby lỏng chứa 2% rỉ đường trong thời gian 2 giờ, sau đó tiến hành kiểm tra bình thường như trên.

3.2.3.2. Xác định số lượng VSVCĐN sống cộng sinh với cây họ đậu (Rhizobium)

Đối với tất cả VSVCĐN sống cộng sinh có thể dùng phương pháp cấy pha loãng trên môi trường YMA. Phương pháp được tiến hành như phần 3.2.3.1. Riêng đối với phân VSVCĐN dùng cho cây đậu đen, đậu xanh, lạc và đậu tương có thể dùng phương pháp nhiễm lên cây chỉ thị, trong đó dùng hạt Sirato (Macroptiliumatropurpureus) cho cây đậu xanh, đậu đen, lạc và hạt đậu tương dại (Glycine ussurieusis) dùng cho đậu tương. Phương pháp được tiến hành như sau:

Pha loãng phân như phần 3.2.3.1

Hạt Sirato ngâm trong H₂SO₄ đặc trong 4 phút sau đó rửa sạch nhanh bằng nước cất 4-5 lần. Hạt cây chỉ thị khác được thanh trùng 3-4 phút trong dung dịch HgCl₂ 1/1000 hay cồn etylic 90^oC trong 2 phút và rửa sạch bằng nước cất vô trùng nhiều lần. Ngâm hạt trong nước cất vô trùng cho đến khi bắt đầu nẩy mầm (khoảng 24-36 giờ) rồi đặt vào ống thạch đã được chuẩn bị với môi trường Jensen như phần 3.2.3. Rót lml dịch kiểm tra có độ pha loãng 10⁶, l0⁷, l0⁸, l0⁹ vào mỗi ống thạch. Mỗi độ pha loãng làm 3 ống. Đậy kín nút bông và đặt vào phòng sinh trưởng có nhiệt độ 28⁰C. Sau 10-15 ngày kiểm tra sự hình thành nốt sần và xác định mật độ tế bào có trong phân bằng cách kiểm tra như bảng 3 (trang bên).

3.2.3.3. Xác định vi sinh vật tạp:

Số lượng vi sinh vật tạp được xác định bằng phương pháp nuôi cấy trên thạch đĩa với môi trường GP. Phương pháp được tiến hành như phần 3.2.3.1.

3.2.3.4. Xác định độ ẩm:

Độ ẩm của phân được xác định bằng phương pháp sấy khô ở nhiệt độ l05⁰C tới khi trọng lượng mẫu không thay đổi (cân 3 lần).

4. Bao bì, ghi nhãn:

Phân VSVCĐN phải được bảo quản trong các bao gói tốt chống được các ảnh hưởng bất lợi bên ngoài. Nhãn hiệu phải có đầy đủ các nội dung sau:

- Đối tượng sử dụng

- Tên vi sinh vật hữu ích có chứa trong sản phẩm

- Mật độ VSVCĐN

- Khối lượng tịnh, khối lượng bao

- Phương pháp, kỹ thuật sử dụng và bảo quản

- Người và ngày kiểm tra chất lượng xuất xưởng

- Ngày và địa điểm sản xuất

- Thời hạn sử dụng

Bảng 3: Xác định mật độ vi khuẩn nốt sần bằng cây chỉ thị: