TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 10486:2014

THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AMPROLIUM BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ

Animal feeding stuffs - Determination of amprolium content by spectrophotometric method

Lời nói đầu

TCVN 10486:2014 được xây dựng dựa theo AOAC 961.24 Amprolium in Feeds. Spectrophotometric Method;

TCVN 10486:2014 do Viện Chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AMPROLIUM BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ

Animal feeding stuffs - Determination of amprolium content by spectrophotometric method

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp đo quang phổ để xác định hàm lượng amprolium trong thức ăn chăn nuôi.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 6952 (ISO 6498), Thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử.

3. Nguyên tắc

Amprolium được chiết ra khỏi thức ăn chăn nuôi bằng hỗn hợp metanol-nước. Dịch chiết được tinh sạch bằng sắc ký trên nhôm oxit, amprolium phản ứng với 2,7-naphthalenediol, kali ferixyanua [K₃Fe(CN)₆], kali xyanua (KCN) và natri hydroxit (NaOH) trong metanol tạo thành hợp chất màu, đo độ hấp thụ của hợp chất này ở bước sóng 530 nm.

Các thành phần thường có trong thức ăn chăn nuôi thương mại, các vitamin, kháng sinh, picolin hoặc pyrimidin không gây nhiễu, còn nithiazide, enheptin A và nitrofurazone có thể gây nhiễu đến phép thử.

4. Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

4.1. Metanol loãng

Trộn 2 thể tích metanol khan với một thể tích nước. Làm nguội đến nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.

4.2. Dung dịch natri hydroxit (NaOH)

Hòa tan 2,25 g natri hydroxit trong 200 ml nước.

4.3. Dung dịch natri hydroxit trong alcol

Pha loãng 15,0 ml dung dịch natri hydroxit (4.2) với metanol khan đến 200 ml. Đậy nắp bình và trộn kỹ.

4.4. Dung dịch kali xyanua (KCN)

Hòa tan 1,0 g kali xyanua trong 100 ml nước. Khi được bảo quản trong bình có nắp đậy kín thì dung dịch này bền được trong 2 tuần.

4.5. Dung dịch kali ferixyanua [K₃Fe(CN)₆]

Hòa tan 200 mg kali ferixyanua trong 100 ml nước. Khi được bảo quản trong bình có nắp đậy kín thì dung dịch này bền được trong 2 tuần.

4.6. Nhôm oxit (Al₂O₃), loại dùng cho sắc ký, phải đạt yêu cầu của phép thử sau: Lắc mạnh 10 g nhôm oxit với 100 ml nước đựng trong bình dung tích 250 ml có nắp đậy thủy tinh trong khoảng trên 2 min. Để lắng, gạn chất lỏng và xác định pH bằng cách đo điện thế. pH phải trong khoảng từ 9,5 đến 10,5. Độ thu hồi của amprolium có thể thay đổi tùy thuộc vào các loại nhôm oxit khác nhau. Kiểm tra độ thu hồi cột bằng phân tích dịch chiết thức ăn chăn nuôi không chứa thuốc có bổ sung chất chuẩn.

4.7. Dung dịch naphthalenediol

Hòa tan 25 mg 2,7-naphthalenediol trong 1 lít metanol khan.

4.8. Thuốc thử hiện màu

Cho 5 ml dung dịch kali ferixyanua (4.5) vào 90 ml dung dịch naphthalenediol (4.7) đựng trong bình cầu dung tích 250 ml có nắp đậy kín và trộn kỹ. Thêm 5 ml dung dịch kali xyanua (4.4), đậy nắp và trộn kỹ rồi để yên từ 30 min đến 35 min. Thêm 100 ml dung dịch natri hydroxit trong alcol (4.3) và trộn. Lọc dung dịch thu được qua bộ lọc thủy tinh có độ xốp trung bình trước khi sử dụng, dùng dung dịch đã chuẩn bị trong vòng 75 min.

4.9. Dung dịch chuẩn amprolium, 25 μg/ml

Cân 25,0 mg chất chuẩn amprolium cho vào bình định mức 50 ml, hòa tan trong metanol loãng (4.1) thêm metanol đến vạch và trộn. Chuyển 5 ml dung dịch thu được vào bình định mức 100 ml, thêm metanol loãng đến vạch. Dung dịch này có thể bền được một tuần.

5. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và các thiết bị, dụng cụ sau đây:

5.1. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.

5.2. Bình cầu, dung tích 250 ml, có nắp thủy tinh đậy kín.

5.3. Pipet, có thể phân phối các thể tích thích hợp.

5.4. Ống ly tâm, dung tích 15 ml.

5.5. Máy ly tâm.

5.6. Giấy lọc, có độ xốp trung bình, ví dụ Whatman No. 42 hoặc loại tương đương.

5.7. Giấy lọc nhanh.

5.8. Phễu Buchner.

5.9. Bông thủy tinh, ví dụ Pyrex hoặc loại tương đương.

5.10. Đũa thủy tinh.

5.11. Máy đo quang phổ hoặc máy đo màu, có thể đo ở bước sóng 530 nm.

5.12. Máy khuấy từ hoặc máy lắc cơ học.

5.13. Cuvet, chiều dài đường quang 1 cm.

5.14. Bơm hút chân không.

5.15. Bình định mức, dung tích 50 ml, 100 ml, 200 ml, 250 ml.

5.16. Ống thủy tinh hoặc cột sắc kí thủy tinh, chiều dài 40 cm, có đường kính trong khoảng 9 mm đến 10 mm.

6. Lấy mẫu

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 4325 (ISO 6497)^[1].

7. Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952, (ISO 6498).

8. Cách tiến hành

8.1. Chiết mẫu

Cân chính xác một lượng mẫu đã nghiền không lớn hơn 15 g có chứa từ 1,5 mg đến 2,5 mg amprolium (không quá 2,5 mg) rồi chuyển sang bình cầu dung tích 250 ml có nắp thủy tinh đậy kín (5.2). Thêm 100,0 ml metanol loãng (4.1), đậy nắp bình và cho khuấy từ hoặc lắc cơ học trong 60 min. Lọc qua giấy lọc(5.6), loại bỏ từ 10 ml đến 15 ml dịch lọc đầu tiên, thu lấy khoảng 25 ml đến 40 ml dịch lọc. Dịch lọc thu được phải trong, lọc lại qua giấy lọc mới hoặc ly tâm cho đến khi dịch lọc trong suốt, nếu cần.

8.2. Sắc ký

8.2.1. Chuẩn bị nhôm oxit

Cho 1 lít nước vào 200 g nhôm oxit (4.6). Khuấy hỗn hợp trong 30 min. Lọc hỗn hợp qua giấy lọc nhanh (5.7) trên phễu Buchner (5.8). Rửa nhôm oxit trên bộ lọc ba lần bằng metanol khan, mỗi lần dùng 100 ml. Làm khô bằng không khí trong điều kiện chân không cho đến khi nhôm oxit đạt đến nhiệt độ phòng. Nhôm oxit đã chuẩn bị cần phải có tính chảy tốt. Bảo quản nhôm oxit trong chai thủy tinh có nắp đậy kín.

8.2.2. Chuẩn bị cột sắc kí

Thu nhỏ một đầu ống thủy tinh dài 40 cm, có đường kính trong khoảng 9 mm đến 10 mm (5.16) bằng cách xoay trong ngọn lửa cho đến khi còn khoảng 4 mm đến 5 mm. Nút bông thủy tinh (5.9) vào đầu dưới của ống và nén bằng đũa thủy tinh (5.10) đến khi thu được bề dày của bông thủy tinh từ 2 mm đến 3 mm. Chuyển 5,0 g nhôm oxit đã chuẩn bị (8.2.1) sang ống khô và nhồi cột bằng cách gõ nhẹ ống. Chuẩn bị cột cho từng mẫu.

CHÚ THÍCH 1: Độ thu hồi của cột amprolium có thể khác nhau giữa các hãng khác nhau. Kiểm tra độ thu hồi của cột bằng cách bổ sung chất chuẩn vào dịch chiết từ mẫu thức ăn chăn nuôi không chứa amprolium.

CHÚ THÍCH 2: Có thể sử dụng cột sắc kí thủy tinh, chiều dài 40 cm, đường kính trong khoảng 9 mm đến 10 mm (5.16).

8.3. Sắc ký dịch chiết mẫu thức ăn chăn nuôi

Dùng pipet (5.3) lấy 25 ml dịch chiết trong suốt (8.1) sang cột (8.2.2). Loại bỏ 3 ml dịch rửa giải đầu tiên và thu lấy 5 ml tiếp theo để hiện màu.

8.4. Phép xác định

Đánh dấu riêng rẽ ba ống ly tâm 15 ml (5.4) là X, S và B. Cho vào ống X 4,00 ml dịch rửa giải trong suốt thu được từ cột (xem 8.3), cho 4,00 ml dung dịch chuẩn amprolium (4.9) vào ống S và cho 4,00 ml metanol loãng (4.1) vào ống B làm mẫu trắng. Cho vào mỗi ống 10,0 ml thuốc thử hiện màu (4.8), đậy nắp, trộn rồi để yên 20 min. Ly tâm từ 2 min đến 3 min, gạn vào các cuvet 1 cm (5.13) và đậy cuvet.

Nếu các dung dịch không trong suốt thì loại bỏ các hạt lơ lửng bằng cách gạn qua nút bông thủy tinh (5.9) vào cuvet.

Xác định độ hấp thụ của các dung dịch X và S trong máy đo quang phổ hoặc máy đo màu (5.11) ở bước sóng 530 nm, dùng dung dịch B làm dung dịch so sánh, trong khoảng từ 20 mm đến 25 min sau khi bổ sung thuốc thử hiện màu.

9. Tính kết quả

Hàm lượng amprolium trong mẫu thức ăn chăn nuôi, X₁, tính bằng phần trăm khối lượng, theo công thức sau:

                                                        (1)

Hàm lượng amprolium trong mẫu thức ăn chăn nuôi, X₂, tính bằng miligam trên kilogam, theo công thức sau:

                                                                 (2)

Trong đó:

A và A’ là độ hấp thụ đo được của dung dịch mẫu thử và dung dịch chuẩn tương ứng;

C là khối lượng amprolium trong phần dung dịch chuẩn đã sử dụng, tính bằng miligam (trong trường hợp này, C = 0,100 mg);

V₁ là thể tích phần mẫu thử sau khi pha loãng bằng metanol (xem 8.1), tính bằng mililit (trong trường hợp này, V₁ = 100,0 ml);

V₂ là thể tích dung dịch thử dùng cho phép xác định (xem 8.4), tính bằng mililit (trong trường hợp này, V₂ = 4,00 ml);

10³ là hệ số chuyển đổi từ gam sang miligam;

W là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g).

10. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;