TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12452:2018

THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT - XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG FENBENDAZOL - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

Meat and meat products - Determination of fenbendazole residues - Liquid chromatographic method

Lời nói đầu

TCVN 12452:2018 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 991.17 Fenbendazole in beef liver. Liquid chromatographic method;

TCVN 12452:2018 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F8 Thịt và sản phẩm thịt biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT - XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG FENBENDAZOL - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

Meat and meat products - Determination of fenbendazole residues - Liquid chromatographic method

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định dư lượng fenbendazol trong thịt và sản phẩm thịt bằng sắc ký lỏng.

Phương pháp này đã được thử nghiệm liên phòng trên mẫu gan bò với giới hạn định lượng từ 800 ng/g đến 1 600 ng/g.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử

3  Nguyên tắc

Mẫu thịt được kiềm hóa bằng natri cacbonat và được đồng hóa trong etyl axetat. Cho bay hơi etyl axetat đến khô, phần còn lại được tách phân đoạn bằng axit phosphoric và hexan. Phân đoạn axit có chứa fenbendazol, được trung hòa và chiết với etyl axetat. Cho bay hơi etyl axetat, phần còn lại được hòa tan trong diclometan và được chuyển qua cột micro silica với pha động là hỗn hợp metanol và diclometan. Cho bay hơi dung môi trong dịch rửa giải, phần còn lại được hòa tan trong pha động để bơm vào cột sắc ký lỏng (LC). Fenbendazol được định lượng ở bước sóng 298 nm.

4  Thuốc thử và vật liệu thử

Sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích và nước đạt loại 3 theo TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), trừ khi có quy định khác.

4.1  Etyl axetat.

4.2  Hexan.

4.3  Diclometan (metylen clorua).

4.4  Metanol, loại tinh khiết phân tích, được chưng cất bằng dụng cụ thủy tinh.

4.5  Etanol khan (cồn tuyệt đối).

4.6  Dimetyl sulfoxit.

4.7  Hydroxytoluen butyl hóa (BHT), dung dịch 10 mg/ml

Hòa tan 1 g BHT trong 100 ml etyl axetat (4.1).

4.8  Natri sulfat khan, dạng hạt.

4.9  Natri cacbonat, dung dịch 1 M

Hòa tan 106 g natri cacbonat khan bằng nước đến 1 L.

4.10  Axit phosphoric, dung dịch 1 M

Pha loãng 68,3 ml axit phosphoric bằng nước đến 1 L.

4.11  Kali hydroxit, dung dịch 10 M

Hòa tan 560 g kali hydroxit dạng viên trong nước và pha loãng đến 1 L. Bảo quản dung dịch trong lọ kín khí.

4.12  Dung dịch đệm dùng cho pha động của sắc ký lỏng, 0,01 M, pH 7,0

Hòa tan 1,15 g amoni dihydro phosphat (NH₄H₂PO₄) trong khoảng 950 ml nước, chỉnh pH đến 7,0 bằng dung dịch amoni hydroxit loãng và thêm nước đến thể tích cuối cùng 1 L. Chuẩn bị ngay trước khi sử dụng.

4.13  Pha động dùng cho sắc ký lỏng

Đệm metanol-amoni dihydro phosphat được chuẩn bị từ các thể tích thích hợp của metanol (4.4) và dung dịch đệm dùng cho pha động LC (4.12) theo tỷ lệ 70 : 30 (phần thể tích). Lọc qua bộ lọc có cỡ lỗ 0,45 µm trước khi sử dụng.

4.14  Dung dịch chuẩn fenbendazol

4.14.1  Dung dịch chuẩn gốc, 1 mg/ml

Hòa tan 10 mg chất chuẩn fenbendazol trong 10 ml dimetyl sulfoxit (4.6).

4.14.2  Dung dịch chuẩn trung gian, 10 µg/ml

Pha loãng 1 ml dung dịch chuẩn gốc (4.14.1) bằng metanol (4.4) đến 100 ml.

4.14.3  Dung dịch chuẩn làm việc, 0,25; 0,5; 1,0; 2,0 và 4,0 µg/ml.

Lấy tương ứng 0,25; 0,5; 1,0; 2,0 và 4,0 ml dung dịch chuẩn trung gian (4.14.2) vào các bình định mức 10 ml riêng rẽ. Cho bay hơi đến khô dưới dòng nitơ; sau đó pha loãng đến vạch bằng hỗn hợp metanol (CH₃OH) và dung dịch đệm dùng cho pha động LC (4.12) với tỷ lệ 53 : 47 (phần thể tích).

Các dung dịch tương đương với nồng độ 25, 50, 100, 200 và 400 ng/g trong 10 g mẫu thịt.

4.15  Khí nitơ.

4.16  Bông thủy tinh.

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể như sau:

5.1  Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 1 mg.

5.2  Cột sắc ký, được trang bị bơm tự động sử dụng vòng lấy mẫu 50 µl và detector UV có khả năng phát hiện ở bước sóng 298 nm.

5.3  Cột C₁₈, dài 25 cm, đường kính trong 0,46 cm, cỡ hạt 5 µm.

5.4  Cột bảo vệ, dài 3 cm, đường kính trong 0,46 cm.

5.5  Cột silica dùng một lần, dung tích 2,8 ml, 500 mg, cỡ hạt 40 µm và cỡ lỗ 60 A (angstrom).

5.6  Bộ lọc, cỡ lỗ 0,2 µm.

5.7  Bộ cô quay, có trang bị nồi cách thủy được duy trì nhiệt độ ở 30°C đến 35 °C.

5.8  Máy trộn, không gây nổ.

5.9  Cốc trộn, bằng thủy tinh, dung tích 500 ml.

5.10  Máy đo pH, có thể đo pH ở điện thế ±1400 mV với độ chính xác ±7 mV hoặc giấy chỉ thị pH.

5.11  Máy trộn Vortex.

5.12  Pipet và micropipet, có thể phân phối các thể tích thích hợp.

5.13  Máy xay thực phẩm.

5.14  Bình cầu đáy tròn, dung tích 250 ml và 500 ml.

5.15  Giấy lọc, số 41.

5.16  Phễu lọc.

5.17  Phễu chiết, dung tích 125 ml và 250 ml.

5.18  Cốc có mỏ, dung tích 100 ml.

5.19  Ống hình côn, dung tích 10 ml hoặc 15 ml.

5.20  Lọ nhỏ (vial), dùng cho LC.

6  Lấy mẫu

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc không bị thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Các bên tự thỏa thuận về phương pháp lấy mẫu, nếu cần.

7  Cách tiến hành

7.1  Chuẩn bị mẫu thử

Dùng máy xay (5.13) để xay nhuyễn mẫu thử.

7.2  Đồng hóa và chiết mẫu

Cân khoảng 10 g phần mẫu thử đã chuẩn bị (xem 7.1), chính xác đến 1 mg, cho vào cốc trộn (5.9). Thêm 5 ml dung dịch natri cacbonat 1 M (4.9) và 150 ml etyl axetat (4.1). Thêm 1 ml dung dịch BHT (4.7). Trộn 5 min ở tốc độ cao, thêm 80 g natri sulfat khan (4.8) và trộn 1 min ở tốc độ thấp. Gạn etyl axetat vào bình cầu đáy tròn 500 ml (5.14) qua phễu (5.16) có giấy lọc số 41 (5.15). Cho mẫu đã nghiền và natri sulfat lắng nhanh trước khi rót, để không bịt giấy lọc. Sử dụng thìa kim loại để nạo phần mô thịt bám xung quanh thành của cốc trộn.

Thêm 150 ml etyl axetat (4.1) vào hỗn hợp trong cốc trộn và trộn 2 min đến 3 min ở tốc độ thấp. Lọc dung dịch etyl axetat vào bình cầu đáy tròn, tráng giấy lọc với khoảng 10 ml etanol tuyệt đối (4.5) và cho bay hơi đến khô trên bộ cô quay (5.7).

7.3  Làm sạch từng phần bằng dung môi

Thêm 10 ml hexan (4.2) vào bình cầu đáy tròn 500 ml chứa phần còn lại thu được từ 7.2, xoay bình để hòa tan phần cặn còn lại và chuyển sang phễu chiết 125 ml (5.17). Rửa bình bằng 10 ml hexan và chuyển nước rửa vào phễu chiết. Rửa bình theo cách tương tự hai lần, mỗi lần 10 ml dung dịch axit phosphoric 1 M (4.10) và chuyển nước rửa vào phễu chiết chứa hexan. Đậy nắp phễu chiết và lắc mạnh 2 min. Để tách lớp khoảng 10 min và rút pha nước ở phía dưới vào phễu chiết 125 ml thứ hai. Chiết lại bằng hexan hai lần nữa, mỗi lần dùng 10 ml dung dịch axit phosphoric 1 M, sau mỗi lần rút pha nước vào phễu chiết thứ hai. Rửa phần mẫu gộp chứa axit bằng cách lắc 30 s với 10 ml hexan.

Tháo pha lỏng phía dưới vào cốc có mỏ 100 ml (5.18). Chỉnh pH đến 8,5 ± 1,0 bằng cách thêm từ từ khoảng 9 ml dung dịch kali hydroxit 10 M (4.11), vừa thêm vừa khuấy. Giữ cốc có mỏ trong nước đá hoặc nước lạnh trong quá trình trung hòa. Kiểm tra pH bằng máy đo pH hoặc giấy chỉ thị pH (5.10).

Chuyển lượng chứa trong cốc có mỏ vào phễu chiết 250 ml (5.17) và tráng cốc bằng tổng cộng 50 ml etyl axetat (4.1), gộp dịch rửa vào phễu chiết. Chiết bằng cách lắc mạnh 2 min và để cho tách pha. Sau đó, tháo lớp nước phía dưới vào cốc có mỏ 100 ml (5.18). Nút cổ phễu bằng bông thủy tinh (4.16) và thêm khoảng 40 g natri sulfat (4.8). Tháo etyl axetat qua phễu thủy tinh vào bình cầu đáy tròn 250 ml (5.14). Đổ lượng chứa trong cốc có mỏ trở lại phễu chiết và chiết lại bằng 50 ml etyl axetat khác. Loại bỏ lớp nước phía dưới và tháo etyl axetat qua phễu chứa natri sulfat vào cùng bình cầu đáy tròn 250 ml nêu trên. Rửa sạch natri sulfat bằng 25 ml etyl axetat và thêm nước rửa vào bình cầu đáy tròn. Thêm 0,2 ml dung dịch BHT (4.7) vào bình cầu đáy tròn và làm bay hơi đến khô trên bộ cô quay (5.7).

7.4  Làm sạch trên cột silica

Thêm 3 ml diclometan (4.3) vào bình cầu đáy tròn đựng phần mẫu thử đã làm sạch bằng dung môi (xem 7.3) và xoay để hòa tan phần còn lại. Cột silica dùng một lần (5.5) được ổn định bằng 2 ml diclometan. Đưa mẫu vào cột đã ổn định, để chảy với tốc độ tự nhiên trong các bước tiếp theo sau đây:

Rửa bình đựng mẫu hai lần, mỗi lần 3 ml diclometan và chuyển phần dịch rửa lên cột.

Rửa cột với 5 ml diclometan và loại bỏ nước rửa.

Rửa giải fenbendazol với 5 ml metanol (4.4) 25 % trong diclometan (4.3) và gom dịch rửa giải vào ống hình côn 10 ml hoặc 15 ml (5.19). Cho bay hơi dịch rửa giải đến khô dưới dòng nitơ (4.15) và hòa tan trong 1,0 ml pha động (4.13). Trộn bằng máy trộn Vortex (5.11) để hòa tan phần còn lại; sau đó lọc qua bộ lọc cỡ lỗ 0,2 µm (5.6) vào lọ đựng mẫu của bộ LC (5.20).

7.5  Phép xác định

Với detector được cài đặt ở bước sóng 298 nm và độ nhạy 0,02 AFS, bơm 50 µl dung dịch mẫu thử (7.4) vào hệ thống LC (5.2), sử dụng pha động 70 + 30 (4.13), với tốc độ dòng 1 ml/min. Thể tích lưu xấp xỉ của fenbendazol là 14 ml.

7.6  Dựng đường chuẩn

Bơm 50 µl hoặc các thể tích được chọn khác của dung dịch chuẩn làm việc fenbendazol (4.14.3) và bằng phép phân tích hồi quy, dựng đường chuẩn giữa nồng độ dung dịch được bơm tính bằng microgam trên mililit (µg/ml) và chiều cao hoặc diện tích pic cho mỗi dung dịch.

8  Tính kết quả

Tính nồng độ fenbendazol trong phần mẫu thử, C, biểu thị bằng microgam trên mililit (µg/ml), từ phép xác định nêu trong 7.5 và dựa vào đường chuẩn (7.6).

Tính hàm lượng fenbendazol trong mẫu thử, X, biểu thị bằng nanogam trên gam (ng/g), theo Công thức sau:

Trong đó:

w là khối lượng phần mẫu thử ban đầu, tính bằng gam (w = 10 g);

V là thể tích dung dịch thử cuối cùng, tính bằng mililit (V = 1,0 ml);

1 000 là hệ số chuyển đổi từ microgam sang nanogam.

9  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;