TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 13760:2023

PHÂN BÓN - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG GLUTAMAT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Fertilizers - Determination of glutamate content by high performance liquid chromatography (HPLC)

Lời nói đầu

TCVN 13760:2023 do Viện Quy hoạch và Thiết kế Nông nghiệp biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

PHÂN BÓN - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG GLUTAMAT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SÁC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Fertilizers - Determination of glutamate content by high performance liquid chromatography (HPLC)

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng glutamat trong phân bón bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau đây là rất cần thiết khi áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng bản được nêu. Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các bản sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987) Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử

TCVN 9486:2018 Phân bón - Lấy mẫu

3  Nguyên tắc

Glutamat trong phân bón được chiết với dung dịch axit clohydric loãng. Dịch lọc được điều chỉnh pH tới 2,2. Glutamat được tách riêng biệt bằng cột trao đổi ion trong thiết bị HPLC và xác định bằng phản ứng với ninhydrin sử dụng detector quang đo ở bước sóng 570 nm.

4  Thuốc thử

Trừ khi có quy định khác, trong quá trình phân tích chỉ sử dụng các hóa chất, thuốc thử có cấp độ tinh khiết phân tích dùng cho HPLC và nước cất hai lần phù hợp với TCVN 4851:1989 (ISO 3696 :1987) hoặc nước có độ tinh khiết tương đương (độ dẫn điện < 10 μS), sau đây gọi là nước.

4.1  Axit clohydric (HCl) đậm đặc, d = 1,19 g/mL.

4.2  Natri hydroxit (NaOH) dạng hạt.

4.3 Thiodiglycol (C₄H₁₀O₂S) độ tinh khiết > 99 %.

4.4  Axit 5-sulfosalicylic (C₇H₆O₆S.2H₂O) thể rắn.

4.5  Natri citrat (Na₃C₆H₅O₇.2H₂O) thể rắn.

4.6  Phenol (C₆H₅OH) thể rắn.

4.7  Natri clorua (NaCl) tinh thể.

4.8  Dung dịch natri hydroxit 1 mol/L: Dùng cân kỹ thuật (5.2) cân 40 g natri hydroxit (4.2) cho vào cốc có sẵn 500 mL nước, hòa tan, chuyển vào bình định mức dung tích 1000 mL, định mức đến vạch, lắc đều.

4.9  Hỗn hợp chiết (axit clohydric 0,1 mol/L chứa 2 % thiodiglycol): Hút 8,2 mL axit clohydric đậm đặc (4.1) pha loãng với khoảng 900 mL nước. Thêm 20 mL thiodiglycol (4.3), chuyển vào bình định mức dung tích 1000 mL lắc đều và định mức đến vạch bằng nước.

CHÚ THÍCH 1: Không trộn trực tiếp axit clohydric đậm đặc (4.1) vào thiodiglycol (4.3)

4.10  Dung dịch axit sulfosalicylic 6 %: Dùng cân kỹ thuật (5.2) cân 60 g axit 5-sulfosalicylic (4.4) vào bình định mức dung tích 1000 mL, thêm nước đến vạch định mức, lắc đều.

4.11  Dung dịch đệm citrat (Na⁺: 0,2 mol/L), pH = 2,2.

Dùng cân kỹ thuật (5.2) cân 19,61 g natri citrat (4.5), 1 g phenol (4.6), 5 mL thiodiglycol (4.3) và 16,50 mL axit clohydric đậm đặc (4.1) vào cốc dung dịch 1000 mL có chứa khoảng 800 mL nước. Điều chỉnh pH tới 2,2. Chuyển vào bình định mức dung tích 1000 mL, thêm nước đến vạch định mức, lắc đều.

4.12  Dung dịch đệm rửa giải, chuẩn bị theo các điều kiện của thiết bị phân tích được sử dụng.

4.13  Thuốc thử ninhydrin, chuẩn bị theo các điều kiện của thiết bị phân tích được sử dụng.

4.14  Dung dịch chuẩn axit glutamic có nồng độ 2,5 μmol/mL trong axit HCl.

Các dung dịch này thường có sẵn trên thị trường.

4.15  Dung dịch chuẩn làm việc sử dụng dung dịch có nồng độ 0,2 μmol/mL.

Dùng cân phân tích (5.1) cân 2,2 g natri clorua (4.7) trong cốc dung tích 100 mL với 30 mL dung dịch đệm citrat (4.11). Thêm 4,00 mL dung dịch chuẩn gốc axit glutamic (4.14) và 0,5 mL dung dịch chất nội chuẩn (4.17). Điều chỉnh pH tới 2,2 bằng dung dịch natri hydroxit 1mol/L (4.8). Chuyển định lượng vào bình định mức dung tích 50 mL và định mức bằng dung dịch đệm citrat (4.11), trộn đều. Bảo quản dưới 5 °C không quá 3 tháng.

4.16  Nocleucin (C₆H₁₃NO₂).

4.17  Dung dịch chất nội chuẩn norleucin 20 μmol/mL

Dùng cân phân tích (5.1) cân 0,6560 g norleucin (4.16) vào bình định mức dung tích 250 mL. Thêm dung dịch đệm citrate (4.11) đến vạch, lắc đều. Bảo quản dưới 5 °C không quá 6 tháng.

5  Thiết bị và dụng cụ

Sử dụng các thiết bị dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm và các dụng cụ, thiết bị sau:

5.1  Cân phân tích, có độ chính xác đến ± 0,00001 g và ± 0,0001 g.

5.2  Cân kỹ thuật, có độ chính xác đến ± 0,01 g.

5.3  Tủ sấy, có điều khiển nhiệt độ.

5.4  Máy ly tâm.

5.5  Máy lắc.

5.6  Rây 0,25 mm.

5.7  Thiết bị HPLC được trang bị như sau:

- Detector tử ngoại ( DAD, MWD, PDA... hoặc tương đương)

- Hệ thống bơm cao áp;

- Buồng điều nhiệt cột tách;

- Máy tích phân hoặc máy vi tính;

- Cột trao đổi ion, thiết bị dẫn suất sau cột cho ninhydrin. Cột được nhồi với các hạt nhựa polystyren đã được sulfonat hóa có khả năng tách axit amin ra khỏi nhau và khỏi các chất khác, dương tính với ninhydrin

- Bộ bơm mẫu tự động hoặc bơm mẫu bằng tay.

5.8  Pipet, dung tích 1,0; 2,0; 5,0; 10 và 25 mL, có vạch chia đến 0,1 mL.

5.9  Giấy lọc, giấy lọc Whatman 0,45 μm hoặc tương đương.

5.10  Màng lọc, 0,2 μm

5.11  Bình định mức, dung tích 25; 50; 100; 1000 mL.

6  Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu

6.1  Lấy mẫu

Lấy mẫu theo TCVN 9486:2018.

6.2  Chuẩn bị mẫu thử

6.2.1  Phân bón dạng rắn

Nghiền mẫu cho đến khi lọt qua lỗ sàng 0,25 mm. Các mẫu có độ ẩm cao sẽ được sấy khô bằng không khí ở nhiệt độ không quá 50 °C hoặc đông khô trước khi nghiền.

6.2.2  Phân bón dạng lỏng

Dạng dung dịch: Mẫu lấy ban đầu không ít hơn 50 mL, trước khi lấy mẫu để tiến hành phép thử, mẫu phải được lắc đều.

Dạng lỏng sền sệt: Mẫu lấy ban đầu không ít hơn 200 g, trước khi lấy mẫu để tiến hành phép thử, mẫu phải được trộn đều.

7  Cách tiến hành

7.1  Chiết mẫu

- Dùng cân phân tích (5.1) cân một lượng mẫu phân bón phù hợp (1 g đến 5 g) đã được chuẩn bị theo (6.2) vào bình tam giác dung tích 250 mL, thêm 100 mL của hỗn hợp dịch chiết (4.10). Lắc đều trong thời gian 60 min, sử dụng máy lắc hoặc máy khuấy từ. Để cho lắng cặn rồi dùng pipet hút 10 mL dung dịch phía trên cho vào cốc có mỏ dung tích 100 mL.

CHÚ THÍCH 2: Lượng mẫu cân nên chứa lượng nitơ khoảng 10 mg và lượng nước không vượt quá 100 mg; Lượng mẫu cân chuẩn bị được tính toán như sau:

trong đó:

N_s  là lượng nitơ trong mẫu thử, tính bằng phần trăm (%);

W_s  là khối lượng của phần mẫu thử tương đương với lượng nitơ khoảng 10 mg, tính bằng miligam (mg).

- Thêm 5 mL dung dịch axit sulfosalicylic 6 % (4.10), trong khi dịch vẫn đang khuấy và tiếp tục khuấy bằng máy khuấy từ trong thời gian 5 min. Lọc hoặc ly tâm phần nổi phía trên để loại bỏ kết tủa;

- Hút 10 mL dung dịch bằng pipet (5.8) cho vào cốc dung tích 100 mL, điều chỉnh pH tới 2,2 bằng dung dịch natri hydroxit 1 moL/L (4.8). Chuyển định lượng dung dịch vào bình định mức dung tích 100 mL, thêm 1 mL dung dịch nội chuẩn (4.17), tráng rửa bằng dung dịch đệm citrat (4.11) và định mức đến vạch bằng dung dịch đệm citrat (4.11).

- Dịch chiết không được sử dụng cùng ngày thì phải bảo quản ở nhiệt độ dưới 5 °C.

7.2  Xác định hàm lượng glutamat bằng HPLC

Đưa dịch chiết (7.1) về nhiệt độ phòng. Lắc đều hỗn hợp và lọc một lượng phù hợp qua màng lọc cỡ 0,2 μm. Đưa dịch lọc sạch vào cột trao đổi ion, sử dụng thiết bị HPLC.

Bơm dung dịch mẫu chuẩn cho đến khi tỷ số chiều cao hoặc diện tích của pic mẫu chuẩn so với mẫu nội chuẩn không thay đổi lớn hơn 1 %. Sau đó, bơm lần lượt dung dịch mẫu chuẩn (4.15) và dung dịch mẫu thử (7.1), lặp lại 2 lần. Đo diện tích hoặc chiều cao pic của glutamic và norleucin.

8  Biểu thị kết quả

Hàm lượng glutamic (X) trong mẫu phân bón, tính bằng % về khối lượng, theo công thức:

trong đó:

  là tỷ số đo giá trị trung bình diện tích hoặc chiều cao của pic mẫu thử với nội chuẩn;

  là tỷ số đo giá trị trung bình diện tích hoặc chiều cao của pic mẫu chuẩn với nội chuẩn;

m’  là khối lượng của glutamic trong dung dịch chuẩn (4.15), tính bằng gam;

m’  là khối lượng của phần mẫu thử đem phân tích (7.1), tính bằng gam;

P_i  là độ tinh khiết của chất chuẩn (%).

Hàm lượng glutamat trong mẫu phân bón, tính bằng phần trăm (%) được tính theo hệ số quy đổi từ axit glutamic.

Kết quả phép thử là giá trị trung bình các kết quả của ít nhất hai lần thử được tiến hành song song, sai lệch giữa chúng không được vượt quá theo quy định của AOAC (tùy thuộc vào mức nồng độ của chất thử) so với giá trị trung bình

Kết quả thử nghiệm thu được, lấy hai chữ số sau dấu phẩy.

9  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải có ít nhất các thông tin sau:

a) Viện dẫn tiêu chuẩn này;