b) Để chuẩn bị dung dịch fucsin bazơ pha loãng: Lấy 10 ml dung dịch fucsin bazơ đặc và thêm vào đó 90,0 ml nước cất;

- Tím tinh thể, dung dịch 1 %;

- Hydro peroxit, dung dịch 3 %.

5. Tiến hành thử nghiệm

5.1. Trình tự cấy mẫu lên trên bề mặt môi trường dinh dưỡng được thực hiện như sau: rót môi trường vào các hộp petri, sơ bộ làm khô ở 50 °C trong thời gian 30 min hoặc ở những điều kiện khác phù hợp với TCVN 5521:1991 (ST SEV 3015 -81).

Rót môi trường nuôi dưỡng vào 2 hộp petri, làm khô và cấy song song lên trên từng bề mặt môi trường 0,1 ml hoặc 0,2 ml sản phẩm hoặc sản phẩm đã pha loãng.

Sau khi cấy truyền lên môi trường, dùng que cấy thủy tinh vô trùng dàn đều mẫu trên bề mặt môi trường trong hộp petri, xem TCVN 5521:1991 (ST SEV 3015-81). Đặt mẫu đã cấy, đáy ở phía dưới vào tủ ấm và nuôi dưỡng ở nhiệt độ 22 °C ± 1 °C trong thời gian 5 ngày. Đếm sơ bộ các khuẩn lạc điển hình ở ngày thứ 3 sau khi ủ.

5.2. Lọc màng được tiến hành theo TCVN 5521:1991 (ST SEV 3051-81) sử dụng màng lọc có đường kính lỗ 0,3 mm. Sau khi lọc chuyển phần lọc lên môi trường nuôi dưỡng dày từ 4 mm đến 5 mm trong hộp petri. ủ mẫu đã cấy, đáy ở dưới vào tủ ấm và nuôi dưỡng ở nhiệt độ 22 °C ± 1 °C trong thời gian 5 ngày. Đếm sơ bộ các khuẩn lạc điển hình ở ngày thứ 3 sau khi ủ.

5.3. Vi khuẩn gây nhầy chủng Leuconostoc trên bề mặt của môi trường tạo nên những khuẩn lạc hơi phồng, tròn, nhầy, sau khi trích biệt bằng kim hoặc que cấy vi khuẩn tạo thành những khuẩn lạc có hình sợi nhầy, đôi khi dài vài xentimet.

5.4. Muốn kiểm tra các khuẩn lạc đã phát triển thuộc vi khuẩn gây nhầy chủng Leuconostoc phải phân lập không ít hơn 5 khuẩn lạc đặc trưng. Chuẩn bị hóa chất, thuốc thử và nhuộm chúng theo Gram, theo quy định hiện hành.

Vi khuẩn gây nhầy chủng Leuconostoc là những khuẩn cầu Gram dương không tạo thành nha bào, có dạng hình cầu hoặc ôvan, phân bố theo từng cặp hoặc từng chuỗi, bao quanh bằng vỏ không bắt màu Gram.

5.5. Từ những khuẩn lạc đã xác định theo 5.4, muốn phát hiện vỏ vi khuẩn, chuẩn bị hóa chất, thuốc thử và nhuộm chúng theo Bury. Muốn vậy trên một phiến kính đã làm sạch mỡ và hơ nóng cho khô, trộn đều một giọt mẫu vi khuẩn với mực đen hoặc dung dịch nigrozin. Dùng phiến kính khác có mài cạnh nhanh chóng chuẩn bị phiến mỏng được đánh dấu và hơ nóng vài lần trên ngọn lửa. Phiến kính được nhuộm màu bằng tím tinh thể hoặc dung dịch fucsin bazơ pha loãng. Rửa cẩn thận trong phép làm khô tấm kính giữa các lớp giấy lọc. Nền thuốc thử nhuộm màu bằng dung dịch mực đen loãng hoặc dung dịch nigrozin. Vi khuẩn nhuộm màu đơn sắc còn vì vi khuẩn không bắt màu.

5.6. Đối với những mẫu cấy đã được kiểm tra về mặt hình thái thì nghiên cứu sự tạo thành men catalaza theo quy định hiện hành.

Các vi khuẩn gây nhầy chủng Leuconostoc không tạo thành men catalaza.

6. Đánh giá kết quả thí nghiệm

6.1. Kết quả được đánh giá theo từng mẫu thử riêng biệt.

6.2. Để đếm số vi khuẩn gây nhầy chủng Leuconostoc theo 5.1, chọn hộp nào trong đó có 15 khuẩn lạc đến 150 khuẩn lạc điển hình đã phát triển.

6.3. Nếu trong 80 % trường hợp, nghĩa là không ít hơn 4 khuẩn lạc trên 5 khuẩn lạc đã được kiểm tra là vi khuẩn gây nhầy chủng Leuconostoc thì kết luận là tất cả các khuẩn lạc điển hình đã phát triển trong hộp petri là thuộc giống này. Trong các trường hợp còn lại các vi khuẩn chủng Leuconostoc được xác định từ tỉ lệ phần trăm của khuẩn lạc đã được khẳng định trên tổng số khuẩn lạc đặc trưng lấy để kiểm tra.

6.4. Để xác định gây nhầy chủng Leuconostoc theo 5.2 có thể chọn các hộp lồng petri trong đó trên màng lọc phát triển không quá 15 khuẩn lạc điển hình.

6.5. Kết quả được xử lý và tính cho 1 g (1 cm³) sản phẩm hoặc thể tích sản phẩm đã lọc được chỉ dẫn trong TCVN 5521:1991 (ST SEV 3015-81).

Phụ lục tham khảo

1. ST SEV 3013-81. Các sản phẩm thực phẩm và gia vị. Thủ tục lấy mẫu để phân tích vi sinh.

2. ST SEV 3014-81. Các sản phẩm thực phẩm và gia vị. Chuẩn bị mẫu cho phân tích vi sinh.

3. ST SEV 381581. Các sản phẩm thực phẩm. Nguyên tắc nuôi cấy vi sinh vật và phương pháp xử lý các kết quả thử nghiệm vi vi sinh.

4. ST SEV 3833-82. Đồ hộp. Chuẩn bị dung dịch thuốc thử, phẩm màu, chất chỉ thị và môi trường dinh dưỡng sử dụng trong phân tích vi sinh.

5. ST SEV 3834-82. Đồ hộp. Phương pháp xác định vi sinh vật kiểu khí trung nhiệt và kị khí không bắt buộc.