Căn cứ vào đặc tính sinh hoá để xác định vi khuẩn. Pha loãng mẫu thử ở các đậm độ khác nhau ria cấy lên môi trường chọn lọc để đếm và tính số vi khuẩn.

3. Lấy mẫu: Theo TCVN 5153-90.

4. Thiết bị và dụng cụ: Theo TCVN 5153-90.

5. Môi trường, thuốc thử:

5.1. Phải dùng các loại hoá chất tinh khiết phân tích, nên sử dụng các thành phần cơ bản hoặc đã chế sẵn, khi dùng phải theo chỉ dẫn của nơi sản xuất. Môi trường thuốc thử phải bảo quản ở nơi tối, nhiệt độ 4⁰C không quá 1 tháng. Định kỳ kiểm tra lại môi trường, thuốc thử bằng giống vi khuẩn tiêu chuẩn.

5.2. Môi trường, thuốc thử (phụ lục A).

5.2.1. Môi trường nước thịt.

5.2.2. Môi trường thạch deoxycholat.

5.2.3. Môi trường thạch Macconkey.

5.2.4. Môi trường nước pepton (để phản ứng Indoa).

5.2.5. Môi trường nước pepton glucose (để thử phản ứng đỏ methyl và Voges-Proskauer).

5.2.6. Môi trường thạch Simmon xitrat.

5.2.7. Môi trường thử Indol (dung dịch Kowacs).

5.2.8. Thuốc thử đỏ methil (M.R.).

5.2.9. Thuốc thử Voges - Proskauer (dung dịch Barritt).

6. Các tiến hành.

6.1 Yêu cầu chung: Các dụng cụ, môi trường, thuốc thử v.v… và thao tác phải vô khuẩn.

6.2. Chuẩn bị mẫu thử: Thịt lạnh đông phải giải đông tự nhiên ở nhiệt độ phòng cho đến khi đạt 13-15⁰C, đồ hộp phải cọ rửa sạch vỏ ngoài, ủ 37⁰C từ 5-7 ngày.

6.3. Chế huyễn phù ban đầu.

6.3.1. Để đếm số vi khuẩn trong 1 gam sản phẩm: Cân 100-225gam (không lấy mỡ, lấy cả chất lỏng nếu có), nghiền trước trong cối sứ, nghiền nhuyễn tiếp trong máy xay thịt từ 2-3 phút với vận tốc 10.000 vòng/phút, vừa nghiền vừa bổ sung dần 9 phần môi trường nước thịt (10^-1).

6.3.2. Để đếm số vi khuẩn trên 100cm² sản phẩm: Dùng những miếng giấy thấm vô khuẩn, có kích thước 5 x 5 cm đã được làm ướt bằng nước muối đẳng trương rồi dán lên bề mặt sản phẩm ở các vị trí khác nhau từ 4-8 miếng (100-200cm²). Sau 2 phút chuyển toàn bộ số giấy thấm vào bình đã đựng sẵn 10-20ml môi trường nước thịt và 10-15 viên bi thuỷ tinh. Lắc cho tan giấy tuỳ theo khối lượng mẫu thử cần sử dụng mà pha loãng thành 1:1 (1ml tương đương với 1m²).

6.4. Đếm số vi khuẩn: Từ huyền phù ban đầu (6.3.) tiếp tục pha loãng 10 lần (10^-1, 10^-2, 10^-3) tuỳ mức nhiễm khuẩn mà quyết định. Mỗi đậm độ cấy vào 2 đĩa môi trường thạch deoxycholt hoặc Macconkey một khối lượng bằng nhau trong khoảng từ 0,1 - 1ml (tuỳ mức nhiễm khuẩn mà quyết định), dàn đều trên mặt thạch hoặc trộn đều trong thạch nóng lỏng ở 45⁰C, đặt sấp đĩa môi trường, ủ 37⁰C. Đọc kết quả 2 lần vào 24 giờ và 48 giờ.

Khuẩn lạc E.Coli to, đục, mặt khô, mầu đỏ.

Căc cứ vào hình dạng, mầu sắc mà đếm; chon 5 khuẩn lạc để giám định tiếp tính chất sinh hoá và xác định tỷ lệ (phụ lục B).

6.5. Thử các phản ứng IMViC.

6.5.1. Phản ứng Indol: Phương pháp theo TCVN 5153 - 90 E.Coli có phản ứng dương tính, lớp thuốc thử trên mặt môi trường có màu đỏ.

Chú thích: E.Coli không điển hình (atypic) có phản ứng âm tính: mầu vàng nhạt.

6.5.2. Phản ứng đỏ methyl (methyl red): Cấy vi khuẩn (6.4) vào môi trường nước pepton glucos, ủ 37⁰C từ 2-4 ngày, nhỏ 5 giọt thuốc thử đỏ methyl vào , đọc kết quả: E.Coli có phản ứng dương tính: mầu đỏ (âm tính: mầu vàng).

6.5.3. Phản ứng Voges - Proskauer: Phương pháp theo TCVN 5153-90.

E.Coli có phản ứng âm tính, không màu hoặc vàng nhạt (dương tính: mầu đỏ).

6.5.4. Trên môi trường thạch Simmon xitrat: Ria cấy vi khuẩn (6.4) trên mặt thạch nghiêng, ủ 37⁰C từ 1-3 ngày E.Coli không sinh trưởng (-).

7. Tính toán kết quả.

7.1. Căn cứ vào kết quả giám định tính chất sinh hoá.

7.2. Căn cứ vào công thức dưới đây để tính số E.Coli trong 1 gam hoặc trên 100cm² sản phẩm.

PHỤ LỤC A

MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY, THUỐC THỬ.

A1. Môi trường nước thịt: Theo phụ lục B TCVN 5153-90.

A2. Môi trường thạch deoxycholat:

- Pepton                                                                                                      10g

- Thạch                                                                                                   18-20g

- Natri deoxycholat                                                                                        1g

- Natri clorua                                                                                                  5g

- Kalihydro phophat (K₂HPO₄)                                                                         2g

- Lactos                                                                                                       10g

- Sắt xitrat                                                                                                     2g

- Đỏ trung tính dung dịch 0,1% trong cồn (neutra - red)                              33,3ml

- Nước cất                                                                                             1.000ml

A.3 Môi trường thạch macconkey

- Pepton                                                                                                      20g

- Thạch                                                                                                   18-20g

- Natri clorua                                                                                                  5g

- Lactos                                                                                                       10g

- Muối mật                                                                                                     5g

- Dung dịch cồn đỏ trung tính 0,1%                                                               5ml

- Nước cất                                                                                             1.000ml

Hoà tan pepton, thạch trong nước đun sôi, chỉnh pH 7,5. Lần lượt hoà tan các thành phần còn lại (trừ đỏ trung tính). Lọc qua bông, chỉnh lại pH 7,5. Cho dung dịch đỏ trung tính vào, lắc mạnh cho tan đều. hấp 115⁰C trong 20 phút, chia vào các đĩa petri mỗi đĩa 15-20ml.

A4. Môi trường nước pepton: Theo phụ lục B TCVN 5153-90.

A5. Môi trường nước pepton-glucose: Theo phụ lục B TCVN 5153-90

A6. Môi trường thạch Simmon-xitrat:

- Ammonium dihydrophotphat (NH₄H­₂PO₄)                                                       1g

- Magiê - sulphat (MgSO₄)                                                                           0,2g

- Kalihydro photphat (K₂HPO₄)                                                                        1g

- Natri xitrat (Na₃C₆H₅O₇.2H₂O)                                                                      2,3g

- Natri clorua (NaCl)                                                                                        5g

- Thạch                                                                                                   18-20g

- Nước cất                                                                                             1.000ml

- Xanh Brôm-thy-môn, dung dịch 0,5-1g

trong cồn (Bromthymol Blue)                                                                  10-20ml

Theo thứ tự lần lượt hoà tan các muối trong nước, cho thạch vào và đun sôi, chỉnh pH 6,8 rồi cho tiếp dung dịch xanh brôm-thy-môn. Lắc đều và lọc qua bông. Chia ra các ống nghiệm 10 x 100mm, mỗi ống từ 3-5ml. Hấp 121⁰C trong 20 phút. Để ống nằm nghiêng cho môi trường đông lại (môi trường có mầu xanh).

A7. Thuốc thử Indol: Theo phụ lục B TCVN 5153-90.

A8. Thuốc thử đỏ methil (Methyl red): Hoà tan 0,04g đỏ methyl trong 60ml cồn 95⁰, sau cho thêm 40ml nước cất.

A9. Thuốc thử đỏ Voges-Proskauer: Theo phụ lục B TCVN 5153-90.

PHỤ LỤC B

KỸ THUẬT ĐẾM VÀ TÍNH SỐ VI KHUẨN (KHUẨN LẠC).

B1. Đếm số bằng mắt thường hoặc kính lúp. Tốt nhất là đếm toàn bộ số vi khuẩn có trên đĩa môi trường, nếu số vi khuẩn nhiều có thể chia đáu đĩa petri thành các phần bằng nhau: 2, 4, 8, 16 rồi đếm số vi khuẩn trong 1 phần, sau nhân với 2, 4, 8, 16 phần tương ứng.

B2. Các chọn đĩa môi trường để đếm.

B2.1. Chọn những đĩa khuẩn lạc mọc riêng biệt, số lượng từ 30-300 vi khuẩn.

B2.2. Nếu 2 đậm độ pha loãng kế tiếp nhau có cùng số đếm từ 30-300 thì lấy số đếm được ở từng đĩa nhân với bội số pha loãng, so sánh tỷ lệ giữa hai giá trị, nếu nhỏ hơn 2 thì lấy số đếm bình quân của cả 2 giá trị. Nếu lớn hơn 2 thì lấy số có giá trị thấp.

B2.3. Nếu các đậm độ pha loãng đều có số đếm trên 300 thì chọn đĩa môi trường có bột số phan loãng cao nhất.

B2.4. Nếu các đậm độ pha loãng đều có số đếm ít hơn 30 thì chọn đĩa môi trường có bội số pha loãng thấp nhất.

B2.5. Cách tính lại số lượng vi khuẩn: Căn cứ vào kết quả giám định 5 khuẩn lạc đại diện cho mỗi nhóm để tính lại số đếm (B2). Nếu cả 5 đều dương tính thì nhóm đó được tính 100% dương tính, nếu có 3 dương tính thì chỉ được tính là 60% dương tính.

B4. Cách tính số vi khuẩn trong 1 gam và trên 100cm² mẫu thử theo công thức:

4.1. Số khuẩn lạc đếm được là số lượng bình quân trên 2 đĩa môi trường có cùng độ đậm pha loãng hoặc ở 2 độ pha loãng kế tiếp nhau và đã được xác minh lại (B3).

B4.2. Trước khi tính cần làm tròn số đếm: Dưới 10 thì làm tròn số hàng chục; dưới 5 thì lấy số hàng chục dưới, trên 5 thì lấy tròn số hàng chục trên, trên 100 nếu số hàng đơn vị là 5 thì lấy số tròn chia chẵn cho 20, các trường hợp khác thì lấy số tròn chia chẵn cho 10.

B4.3. Thí dụ và cách tính:

B4.3.1. Thí dụ: 1ml mẫu thử ở độ đậm pha loãng 10^-2 được cấy đều trên 2 đĩa môi trường. Đĩa 1 có 65 khuẩn lạc gồm 55 điển hình và 10 không điển hình. Đĩa 2 có 85 khuẩn lạc gồm 82 điển hình và 3 không điển hình.

B4.3.2. Cách tính:

- Tổng khuẩn lạc đếm được trên 2 đĩa: 150 gồm 137 điển hình và 13 không điển hình.

- Sau khi chọn và giám định lại 5 khuẩn lạc ở mỗi nhóm thì thấy (giả thiết) cả 5 khuẩn lạc ở nhóm điển hình đều không dương tính. Chiếm tỷ lệ 100% (5/5). Có 3 trong nhóm không điển hình dương tính chiếm tỷ lệ 60% (3/5).

- Căn cứ vào tỷ trên, số khuẩn lạc được tính lại như sau:

Đĩa 1 + 2 = 137 + 13 x 60%

= 137 + 7,8

= 137 + 8 (số tròn)

= 145

= 140 (số làm tròn)

Số bình quân =  = 70

x 1g = 70 x  x

= 70 x 10²

= 7 x 10³

- Nếu tính số vi khuẩn trên 100cm² diện tích mẫu thử  cũng tính như trên rồi nhân với 100.