TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 5461:1991

CHẤT TẨY RỬA TỔNG HỢP CHỨA ENZYM

PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ PROTEIN

Synthetical Detergent

Method for the determination of proteinous activity

Tiêu chuẩn này phù hợp với ST SEV 4156-83

1. Nguyên tắc của phương pháp

Phương pháp dựa trên sự thuỷ phân của cazein ở ph 10,5, nhiệt độ 40⁰ C và xác định hàm lượng tirazin trong dịch thuỷ phân bằng phép đo màu với thuốc thử folin

2. Thiết bị và dụng cụ

2.1 Máy điều hoà nhiệt đảm bảo nhiệt độ ( 40 ± 0,1)⁰ C

2.2 Ph met

2.3 Máy khuấy từ

2.4 Máy đo màu quang điện

2.5 Phễu thuỷ tinh đường kính 5 đến 7 mm.

2.6 B ếp c ách thu ỷ

2.7 Ống nghi ệm thu ỷ tinh đ ư ờng k ính 15 đ ến 19 mm, cao 150 đ ến 180 mm

2.8 Gi ấy ch ỉ th ị ( kali iodua)

3. Thu ốc th ử v à dung dịch

Khi xác định, dùng các hoá chất loại tinh khiết hoá học hoặc tinh khiết phân tích và dùng nước cất phù hợp với TCVN 2117-77.

Các thuốc thử được cân với độ chính xác 0,01 g.

3.1 Cazein theo Hammersten.

3.2 Natri hidroxit , dung dịch 1 mol/dm³

3.3 Natri vonframat ( Na₂ WO₄ . H₂O )

3.4 Natri molipdat ( Na₂ MoO₄ . 2H₂O )

3.5 Axit otophotphoric, d 1,689 g /cm³.

3.6 Axit clohidric đặc

3.7 Lithi sunfat ( Li₂SO₄ )

3.8 Brom

3.9 Natri bicacbonat, dung dịch 0,2 mol / dm³, chuẩn bị như sau:cân 16,8 g natri bicacbonat, chuyển vào bình định mức dung tích 1000 cm³ và dùng nước định mức đến vạch.

3.10 Natri cacbonat, dung dịch 0,2 mol /dm³, chuẩn bị như sau: cân 21,2 g natri cacbonat khan, chuyển vào bình định mức dung tích 1000 cm³ và dùng nước định mức dến vạch.

3.11 Dung dịch đệm, chuẩn bị như sau : cho 45 cm³ dung dịch natri cacbonat và 5 cm³ dung dịch natri cacbonat vào bình định mức dung tích 200 cm³, thêm nước đến vchj mức và lắc đều.

3.12. Cazein , dung dịch 1 % ( chất nền ), chuẩn bị như sau : cân 2 g cazein theo Hammerstan chính xác đến 0,0001 g, chuyển vào bình nón dung tích 300 cm³ và thêm 140 cm³ dung dịch đệm pH 10,7. Đặt bình nón lên máy khuấy từ và dung dịch 30 phút, sau đó vừa khuấy vừa đun nóng dung dịch trên bếp cách thuỷ ở 70 ⁰C đến hoà tan hoàn toàn.

Để nguội dung dịch đến nhiệt độ 40⁰C và đưa pH đến 10,5 bằng dung dịch natri hidroxit . Sau đó chuyển dung dịch cazein từ bình nón vào bình định mức dung tích 200 cm³ và dung dịch đệm đưa thể tích đến 180 -190 cm³.

Tiếp tục làm lạnh dung dịch cazein bằng dòng nước đến 20⁰C và dùng dung dịch đệm đưa thể tích đến 200 cm³ . Thời hạn bảo quản dung dịch cazein trong tủ lạnh không quá hai ngày. Rót 700 cm³ nước vào bình dung tích 1500 cm³ , thêm 100 g natri vonframat và 25 g natri molipdat, sau đó thêm vào bình 50 cm³ axit octophotphoric và 10 cm³ axit clohidric đặc. Lắp sinh hàn hồi lưu và đun sôi dung dịch trong 10 giờ.

Để nguội dung dịch và thêm vào dung dịch nguội 150 g lithi sunfat, 50 cm³ nước và 4-5 giọt brom dư ( kiểm tra bằng giấy chỉ thị ). Dung dịch phải có màu vàng. Nếu dung dịch có màu xanh lục thì cần phải chế hoá lại bằng brom như tỷtên.

Sau khi dung dịch vừa nguội, thêm nước đến thể tích 1000 cm³ và lọc dung dịch qua giấy lọc. Bảo quản dung dịch trong bình màu tối trong tủ lạnh. Qua 2 -3 tháng bảo quản, thêm vào dung dịch 1 -2 giọt brom và lại đun sôi. Thời hạn sử dụng của dung dịch kiềm folin không quá 1 năm. Khi dung dịch vẩn đục và chuyển sang màu lục thì không còn dùng được nữa.

Dung dịch làm việc được chuẩn bị trước khi tiến hành xác định bằng cách dùng nước pha loãng dung dịch gốc theo tỷ lệ 1 + 3

3.14 Axit tricloaxetic, dung dịch 0,3 mol / dm³, chuẩn bị như sau: cân 49,05 g axit tricloaxetic axit vào bình định mức dung tích 100 cm³ và dùng nước định mức đến vạch.

3.15 Natri cacbonat, dung dịch 0,5 mol/dm³, chuẩn bị như sau : cân 53 g natri cacbonat vào bình định mức dung tích 100 cm³ và định mức đến vạch.

4. Chuẩn bị mẫu

Chuẩn bị dung dịch chất tẩy rửa cần thử : cân 10 g chất tẩy rửa cần thử vào bình định mức dung tích 1000 cm³ và dùng nước định mức dung dịch tới vạch. Lấy 25 cm³ dung dịch đã chuẩn bị vào bình định mức dung tích 100 cm³ và dùng nước định mức dung dịch đến vạch.

Tiếp tục pha loãng dung dịch đến khi ở lần pha loãng cuối cùng lượng proteaz kiềm trong 2 cm³ hỗn hợp phản ứng không vượt quá 0,75 -1,0 mg.

5. Tiến hành xác định

Cho vào ống nghiệm thứ nhất (ống nghiệm kiểm tra) 5 cm³ dung dịch cazein và giữ ống nghiệm trong máy ổn nhiệt ở nhiệt độ 40⁰C trong khoảng 5 phút. Thêm vào ống nghiệm 2,5 cm³nước, lắc và lại đưa vào máy ổn nhiệt và tiếp tục giữ ở nhiệt độ 40⁰C trong khoảng 60 phút.

Sau đó lấy số ống nghiệm tương ứng với số lần pha loãng dung dịch gốc, thêm vào mỗi ống nghiệm 5 cm³ dung dịch cazein , cần phải làm hai mẫu kép cho mỗi lần pha loãng. Gĩư các ống nghiệm 5 phút ở nhiệt độ 40⁰C trong khoảng 60 phút.

Sau khi sự thuỷ phân kết thúc, thêm vào mỗi ống nghiệm, bắt đầu từ ống nghiệm kiểm tra, 5 cm³ dung dịch axit tricloaxetic để ngăn phản ứng và kết tủa cazein không thuỷ phân.

Nhanh chóng lắc đều hỗn hợp và giữ hỗn hợp trong máy điều nhiệt ở nhiệt độ 40⁰C trong khoảng 15 phút để kết tủa hoàn toàn. Sau khi lọc dung dịch qua giấy lọc, xác định trong nước lọc lượng protein thuỷ phân theo hàm lượng tirazin tạo ra. Muốn vậy, lấy từng 2 cm³ nước lọc vào các ống nghiệm và thêm chậm vào từng ống nghiệm 5 cm³ dung dịch natri cacbonat có nồn độ 0,5 mol / dm³ và 1cm³ dung dịch làm việc của thuốc thử folin. Gĩư dung dịch nhận được trong máy ổn nhiệt ở 40⁰C trong khoảng 30 phtú đén lúc xuất hiện màu xanh, sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng và đo mất độ quang của dung dịch so sánh với mẫu kiểm tra trên máy so màu . Đo màu quang điện ở độ dài sóng 656 -677 nm, dùng cuvet có bề dày lờp hấp thụ 5 mm.

6. Tính kết quả

6.1 Hoạt độ protein ( X ) tính theo đơn vị POLP trên 1 g chất tẩy rửa được tính theo công thức :

Trong đó :

D- mật độ quang của dung dịch thử.

m- hàm lượng enzim trong 2 cm³ nước lọc, mg;

4,7 và 0, 1 – các hằng số thực nghiệm

1000 - hệ số chuyển mg thành g.

6.2 Sai số tương đối của phép xác định là giá trị trung bình cộng các kết qua xác định 2 mẫu song song chất tảy rưă.

Phụ lục tham khảo:

Thuật ngữ và định nghĩa:

Đơn vị hoạt độ protein là lượng enzim làm xúc tác cho quá trình thuỷ phân 1 g cazein khi chuyển nó thành 30 % trong các điều kiện quy định ( nhiệt độ 40⁰C, pH10,5 và thời gian thuỷ phân 60 phút)