Giới thiệu chung về Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8322:2010
Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8322:2010 quy định phương pháp xác định dư lượng thuốc bảo vệ thực vật 2,4-D (axit 2,4-dichlorophenoxyacetic) trong rau quả bằng phương pháp sắc ký khí. Đây là văn bản kỹ thuật quan trọng làm cơ sở pháp lý và kỹ thuật cho các phòng thử nghiệm nhằm kiểm soát hàm lượng hóa chất bảo vệ thực vật nhóm kích thích sinh trưởng và diệt cỏ trên các sản phẩm nông sản lưu thông trong nước cũng như xuất khẩu.
Điều 1: Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định chi tiết về phạm vi đối tượng và giới hạn áp dụng của phương pháp phân tích:
- Đối tượng áp dụng: Áp dụng trực tiếp đối với các loại rau tươi, quả tươi và các sản phẩm rau quả đã qua chế biến hoặc bảo quản.
- Mục đích phân tích: Xác định chính xác dư lượng hoạt chất 2,4-D ở dạng axit tự do, dạng muối hoặc dạng este có trong mẫu thử.
- Ý nghĩa thực tiễn: Giúp các cơ quan quản lý nhà nước và doanh nghiệp đánh giá sự phù hợp của sản phẩm so với giới hạn dư lượng tối đa cho phép (MRL) theo quy định an toàn thực phẩm quốc gia và quốc tế.
Điều 2: Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau đây là bộ phận không thể tách rời khi áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu; đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất:
- TCVN 4851 (ISO 3696): Tiêu chuẩn về nước dùng cho phòng thí nghiệm phân tích, yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử. Việc áp dụng tiêu chuẩn này nhằm đảm bảo độ tinh khiết của nước sử dụng trong suốt quá trình phân tích, tránh gây nhiễu kết quả sắc ký.
- Các tiêu chuẩn liên quan đến phương pháp lấy mẫu rau quả tươi để xác định dư lượng thuốc bảo vệ thực vật, đảm bảo mẫu thử mang tính đại diện cao nhất cho lô hàng.
Điều 3: Nguyên tắc của phương pháp
Quy trình xác định dư lượng 2,4-D tuân thủ nghiêm ngặt theo các bước nguyên lý hóa - lý hiện đại:
- Chiết xuất mẫu: Dư lượng 2,4-D trong nền mẫu rau quả được giải phóng và chiết xuất bằng dung môi hữu cơ thích hợp trong môi trường axit hóa (thường sử dụng axit clohydric hoặc axit sunfuric để chuyển hoàn toàn các dạng muối của 2,4-D về dạng axit tự do dễ hòa tan trong pha hữu cơ).
- Làm sạch dịch chiết (Clean-up): Dịch chiết sau khi thu hồi được làm sạch bằng phương pháp phân bố lỏng - lỏng hoặc sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) với các chất hấp phụ phù hợp nhằm loại bỏ tối đa các hợp chất đồng chiết (như chất béo, sắc tố, axit hữu cơ khác) có thể gây ảnh hưởng đến cột sắc ký và đầu dò.
- Dẫn xuất hóa (Este hóa): Do axit 2,4-D tự do có độ bay hơi kém, không thể phân tích trực tiếp bằng sắc ký khí. Do đó, mẫu sau khi làm sạch phải được tiến hành dẫn xuất hóa để chuyển thành dạng metyl este (hoặc dạng este bay hơi khác) bằng các tác nhân alkyl hóa thích hợp (như diazometan hoặc boron triflorua trong metanol).
- Phân tích trên hệ thống sắc ký khí (GC): Dẫn xuất este của 2,4-D được bơm vào hệ thống sắc ký khí. Quá trình định tính và định lượng được thực hiện bằng cách so sánh thời gian lưu và diện tích pic (hoặc chiều cao pic) của mẫu thử với mẫu chuẩn trên đầu dò cộng kết điện tử (ECD) hoặc đầu dò khối phổ (MS).
Điều 4: Thuốc thử và vật liệu thử
Để đảm bảo độ chính xác và độ lặp lại của phép đo, tiêu chuẩn yêu cầu nghiêm ngặt về chất lượng của các loại hóa chất và vật liệu sử dụng:
- Yêu cầu chung: Chỉ sử dụng các thuốc thử có cấp độ tinh khiết phân tích (AR) hoặc cấp độ chuyên dùng cho phân tích sắc ký khí (GC grade). Nước sử dụng phải đạt tiêu chuẩn loại 3 theo TCVN 4851 (ISO 3696) hoặc tinh khiết hơn.
- Chất chuẩn: Chất chuẩn 2,4-D tinh khiết hóa học với hàm lượng hoạt chất đã biết rõ (thường lớn hơn 98%). Dung dịch chuẩn gốc và các dung dịch chuẩn làm việc phải được bảo quản trong các lọ thủy tinh tối màu ở nhiệt độ lạnh theo đúng chỉ dẫn của nhà sản xuất để tránh bị phân hủy bởi ánh sáng và nhiệt độ.
- Dung môi hữu cơ: Bao gồm axeton, dietyl ete, n-hexan, metanol, toluen, etyl axetat... Tất cả phải được kiểm tra độ sạch (không chứa tạp chất gây nhiễu ở vùng thời gian lưu của 2,4-D) trước khi đưa vào sử dụng.
- Tác nhân dẫn xuất hóa và các hóa chất hỗ trợ: Diazometan (hoặc hỗn hợp BF3/metanol), natri sunfat khan (để làm khô dịch chiết), các dung dịch axit và kiềm để điều chỉnh pH trong quá trình chiết và phân bố lỏng - lỏng.
Vegetables and fruits – Determination of 2,4-D residues – Gas chromatographic method
Lời nói đầu
TCVN 8322 : 2010 do Cục Bảo vệ thực vật biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
RAU QUẢ - XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG 2,4-D – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ KHÍ
Vegetables and fruits – Determination of 2,4-D residues – Gas chromatographic method
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định dư lượng thuốc bảo vệ thực vật 2,4-D trong rau và quả bằng sắc kí khí.
Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.
Dư lượng 2,4-D trong mẫu thử được chiết bằng dung môi metanol, được este hoá và được xác định bằng thiết bị sắc kí khí với detector cộng kết điện tử (ECD).
Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích, nước loại 3 của TCVN 4851 (ISO 3696), trừ khi có quy định khác.
4.1. Diclomotan
4.2. n-hexan
4.3. Axit sulfuric đậm đặc
4.4. Natri sulfat khan, hoạt hoá ở 130oC trong 8h, để nguội trong bình hút ẩm, bảo quản trong bình kín.
4.5. Celite 545
4.6. Giấy chỉ thị pH
4.7. Dung dịch H2SO4, nồng độ 3M
4.8. Dung dịch NaOH, nồng độ 5M
4.9. Dung dịch NaHCO3
Cân 4g NaHCO3 vào bình nón dung tích 100ml, thêm nước đến vạch và trộn
4.10. Hỗn hợp dung môi 1, chứa nước cất và metanol với tỉ lệ thể tích 2 : 8
4.11. Hỗn hợp dung môi 2, chứa axit sulfuric đậm đặc và metanol với tỉ lệ thể tích 1 : 9
4.12. Chất chuẩn 2,4-D và 2,4-D metyl este, đã biết độ tinh khiết.
4.13. Dung dịch chuẩn gốc, nồng độ 1000 mg/ml
Dùng cân phân tích (5.10) cân 0,01g từng chất chuẩn 2,4-D và 2,4-D metyl este (4.12), chính xác đến 0,01 mg, cho vào các bình định mức dung tích 10ml (5.1), thêm n-hexan đến vạch và trộn.
4.14. Dung dịch chuẩn trung gian, nồng độ 10 mg/ml
Dùng micropipet (5.3) lấy 200 ml dung dịch chuẩn gốc 2,4-D metyl este (4.13) cho vào bình định mức dung tích 20ml (5.1), thêm n-hexan đến vạch và trộn.
4.15. Dung dịch chuẩn kiểm tra hiệu suất thu hồi, nồng độ 10mg/ml
Dùng micropipet (5.3) lấy 200 ml dung dịch chuẩn gốc 2,4-D (4.13) cho vào bình định mức dung tích 20ml (5.1), thêm n-hexan đến vạch và trộn.
4.16. Dung dịch chuẩn làm việc
Pha loãng liên tục dung dịch chuẩn trung gian (4.14) để thu được 3 dung dịch chuẩn làm việc với các nồng độ tương ứng là 1mg/ml (dung dịch chuẩn làm việc 1), 0,5mg/ml (dung dịch chuẩn làm việc 2) và 0,05mg/ml (dung dịch chuẩn làm việc 3)
Các dung dịch chuẩn làm việc được bảo quản ở 4oC và có thời hạn sử dụng là 6 tháng.
4.17. Khí nitơ, có độ tinh khiết không nhỏ hơn 99,999%
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm như sau:
5.1. Bình định mức, dung tích 10ml và 20ml
5.2. Pipet, dung tích 1ml, 2ml và 5ml
5.3. Micropipet, dung tích từ 50ml đến 200ml
5.4. Cốc ly tâm, dung tích 250ml hoặc loại tương đương.
5.5. Bình cầu, dung tích 100ml
5.6. Bình nón, dung tích 100ml và 500ml
5.7. Phễu chiết, dung tích 100ml và 250ml
5.8. Xylanh, dung tích 10ml, chia vạch đến 1ml
5.9. Ống đong, dung tích 25ml
5.10. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,01mg
5.11. Cân, có thể cân chính xác đến 0,01g
5.12. Bộ phễu lọc Buchner
5.13. Thiết bị đồng hoá Ultra-Turrax, tốc độ không nhỏ hơn 13 500 r/min
5.14. Thiết bị cô quay chân không
5.15. Máy nghiền mẫu
5.16. Máy ly tâm, tốc độ không nhỏ hơn 2000 r/min, ống ly tâm dung tích 250ml
5.17. Thiết bị sắc kí khí, được trang bị như sau:
- buồng bơm mẫu, chia dòng và không chia dòng;
- detector cộng kết điện tử (ECD)
- cột mao quản DB-5, có chiều dài 30m đường kính 0,32 mm, chiều dày pha tĩnh 0,25ml, hoặc loại tương đương;
- máy vi tính
Việc lấy mẫu không được quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 5139 : 2008 (CAC/GL 33-1999) Phương pháp khuyến cáo lấy mẫu để xác định dư lượng thuốc bảo vệ thực vật phù hợp với các giới hạn dư lượng tối đa (MRL)
7.1. Yêu cầu chung
Toàn bộ quá trình phân tích nên được thực hiện trong ngày. Nếu không phân tích được trong ngày thì phải bảo quản dịch mẫu ở 4oC.
7.2. Chuẩn bị mẫu
Mẫu thử được nghiền trong máy nghiền mẫu (5.15) đến khi đồng nhất
7.3. Chuẩn bị phần mẫu thử
7.3.1. Chiết tách
Dùng cân (5.11) cân khoảng 50g (m) mẫu thử đã được đồng nhất (xem 7.2), chính xác đến 0,01g, vào cốc ly tâm dung tích 250ml (5.4). Thêm vào cốc 100ml hỗn hợp dung môi 1 (4.10) và 5g celite (4.5), đồng hoá trong 30s bằng thiết bị Ultra-Turrax (5.13) với tốc độ 13 500 r/min, sau đó lọc bằng bộ lọc Buchner (5.12), tráng rửa bằng 30ml hỗn hợp dung môi 1 (4.10). Chuyển toàn bộ dịch lọc vào bình nón dung tích 500ml (5.6), dùng pipet (5.2) thêm 1ml dung dịch NaOH 5M (4.8), kiểm tra và điều chỉnh pH khoảng 10. Cô cạn (làm bay hơi) toàn bộ metanol bằng thiết bị cô quay chân không (5.14) ở 40oC, thu được dung dịch A.
7.3.2. Làm sạch
Chuyển toàn bộ dung dịch A vào phễu chiết dung tích 250ml (5.7), dùng 50ml nước cất để tráng rửa. Chiết hai lần, mỗi lần bằng 25ml diclometan (4.1), loại bỏ pha hữu cơ (pha dưới). Dùng pipet (5.2) thêm 5ml dung dịch H2SO4 3M (4.7), kiểm tra và điều chỉnh pH khoảng 2. Chiết 3 lần, mỗi lần bằng 25ml diclometan (4.1), thu pha hữu cơ (pha dưới) vào bình cầu dung tích 100ml (5.5), loại bỏ nước bằng natri sulfat khan (4.4). Cô cạn (làm bay hơi) bằng thiết bị cô quay chân không (5.14) ở 40oC.
7.3.3. Este hoá
Dùng pipet (5.2) cho 5ml hỗn hợp dung môi 2 (4.11) vào bình cầu (xem 7.3.2), để yên 10 min ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lắc nhẹ. Chuyển dịch đã được este hoá vào phễu chiết dung tích 100ml (5.7), dùng 15ml nước cất tráng rửa. Chiết 1 lần bằng 10ml (VE) n-hexan, loại bỏ pha nước (pha dưới). Rửa pha hữu cơ bằng 15ml dung dịch NaHCO3 (4.9). Dùng pipet (5.2) lấy khoảng 2ml pha hữu cơ (pha trên) để thu được phần mẫu thử.
7.4. Chuẩn bị phần mẫu trắng
Mẫu trắng là mẫu được biết không chứa dư lượng 2,4-D và được chuẩn bị theo quy trình trong 7.3
7.5. Chuẩn bị mẫu kiểm tra hiệu suất thu hồi
Dùng cân (5.11) cân khoảng 50g mẫu trắng đã được đồng nhất (xem 7.2), chính xác đến 0,01g, vào cốc ly tâm dung tích 250ml (5.4). Dùng micropipet (5.3) thêm 100ml dung dịch chuẩn kiểm tra hiệu suất thu hồi (4.16), để yên trong nhiệt độ phòng tối thiểu 15 min. Tiếp tục thực hiện theo 7.3.
7.6. Điều kiện phân tích
| Nhiệt độ buồng bơm mẫu: | 240oC; |
| Thể tích bơm mẫu: | 1ml, không chia dòng; |
| Nhiệt độ cột tách: | nhiệt độ ban đầu 80oC giữ trong 1 min, sau đó tăng dần với tốc độ tăng 40oC/min đến nhiệt độ 160oC, 3oC/min đến 250oC, 10oC/min đến nhiệt độ cuối 280oC và giữ trong 10 min; |
| Tốc độ khí mang (N2) | 2ml/min; |
| Nhiệt độ detector | 300oC; |
| Tốc độ nitơ bổ trợ | 60ml/min. |
7.7. Dựng đường chuẩn
Dựng đường chuẩn của 2,4-D (tương quan giữa diện tích/chiều cao pic và nồng độ chất chuẩn) tại 3 điểm có nồng độ tương ứng trong dung dịch chuẩn làm việc 1, dung dịch chuẩn làm việc 2 và dung dịch chuẩn làm việc 3 (4.16).
7.8. Xác định
Bơm lần lượt dung dịch mẫu trắng (7.4), dung dịch mẫu thử (7.3), dung dịch mẫu kiểm tra hiệu suất thu hồi (7.5) vào thiết bị sắc kí khí (5.17). Xác định nồng độ của các dung dịch dựa vào đường chuẩn. Nếu nồng độ của mẫu thử nằm ngoài đường chuẩn thì điều chỉnh bằng cách pha loãng dung dịch phần mẫu thử (không pha loãng lượng mẫu bơm).
Dư lượng 2,4-D, X, biểu thị bằng miligam trên kilogam (mg/kg), được tính theo công thức:
Trong đó:
Xo là nồng độ 2,4-D được xác định bằng đường chuẩn (xem 7.8), tính bằng microgam trên mililit (mg/ml);
VE là thể tích n-hexan (xem 7.3.3), tính bằng mililit (ml);
m là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g);
P là độ tinh khiết của chất chuẩn, tính bằng phần trăm (%);
0,94 là hệ số chuyển đổi từ 2,4-D metyl este sang 2,4-D.
9. Hiệu suất thu hồi và giới hạn xác định
9.1. Hiệu suất thu hồi của phương pháp: từ 70% đến 110%.
9.2. Giới hạn định lượng của phương pháp (LOQ): 0,01 mg/kg.
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
a) mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;
b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn, và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng đến kết quả;
e) kết quả thử nghiệm thu được.
[1] British Crop Protection Council 2003, The Pesticide Manual.
[2] Federal Republic of Germany, 1992, Manual of Pesticide Residue Analysis, Volume II.
- 1 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8318:2010 về rau quả - Xác định dư lượng chlorothalonil - Phương pháp sắc ký khí-khối phổ
- 2 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8319:2010 về rau quả - Xác định dư lượng thuốc bảo vệ thực vật - Phương pháp sắc ký khí
- 3 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8323:2010 về rau quả - Xác định dư lượng flusilazole - Phương pháp sắc ký khí
- 4 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8324:2010 về rau quả - Xác định dư lượng cymoxanil - Phương pháp sắc ký khí
- 1 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4851:1989 (ISO 3696-1987) về nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm
- 2 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5139:2008 (CAC/GL 33-1999) về phương pháp khuyến cáo lấy mẫu để xác định dư lượng thuốc bảo vệ thực vật phù hợp với các giới hạn dư lượng tối đa (MRL)
- 3 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8318:2010 về rau quả - Xác định dư lượng chlorothalonil - Phương pháp sắc ký khí-khối phổ
- 4 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8319:2010 về rau quả - Xác định dư lượng thuốc bảo vệ thực vật - Phương pháp sắc ký khí
- 5 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8323:2010 về rau quả - Xác định dư lượng flusilazole - Phương pháp sắc ký khí
- 6 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8324:2010 về rau quả - Xác định dư lượng cymoxanil - Phương pháp sắc ký khí