TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 8400-15:2011

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 15: BỆNH XOẮN KHUẨN DO LEPTOSPIRA

Animal disease - Diagnostic procedure - Part 15: Leptospirosis

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Các phòng thí nghiệm sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các nguyên tắc bảo đảm an toàn sinh học để không phải bị nhiễm bệnh nghề nghiệp hoặc thất thoát các mầm bệnh từ phòng thí nghiệm ra môi trường.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh xoắn khuẩn đối với gia súc.

2. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

Bệnh xoắn khuẩn do leptospira (leptospirosis disease)

Bệnh do các chủng xoắn khuẩn Leptospira thuộc loại vi khuẩn hiếu khí gây ra trên người và gia súc, gây sốt, vàng da, đái ra huyết sắc tố hay máu, viêm gan thận, rối loạn tiêu hóa và có thể sảy thai. Gia súc (lợn) bị bệnh nặng khi mổ ra có mùi khét.

3. Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có Rnase, trừ có quy định khác.

- Cồn 96 ^o

- Bovine albumin serum (BSA)

- Thạch

- Kháng nguyên Leptospira (15 chủng - Phụ lục B).

4. Thiết bị và dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

- Kính hiển vi nền đen, vật kính 10 hoặc 20

- Tủ lạnh thường, tủ ấm, tủ sấy

- Nồi chưng cách thuỷ, nồi hấp tiệt trùng

- Máy hoặc bút đo pH

- Buồng cấy vô trùng

- Máy cất nước

- Micropipet, thể tích hút từ 10 µl cho tới 1000 µl

- Bình nón các loại, ống đong hình trụ các loại

- Lam kính, lamen, khay để lam kính

- Que trộn, đèn cồn, bút chì viết kính

- Ống nghiệm các loại, giá để ống nghiệm

- Màng lọc milipore 0,22 µm.

5. Cách tiến hành

5.1. Chẩn đoán lâm sàng

5.1.1 Đặc điểm dịch tễ

Bệnh thường xảy ra vào mùa mưa, lũ lụt.

Các loài gậm nhấm và thú hoang được coi là nguồn mang bệnh chủ yếu.

Đường xâm nhập của vi khuẩn chủ yếu qua đường tiêu hóa, gia súc ăn phải thức ăn nước uống nhiễm nước tiểu của gia súc mang mầm bệnh và nhiễm nước tiểu của loài gậm nhấm, do sự lây nhiễm với gia súc nuôi tại nhà (chó).

5.1.2 Triệu chứng lâm sàng

5.1.2.1 Thể cấp tính

5.1.2.1.1 Trâu bò, dê, cừu

- Sốt kéo dài từ 1 ngày đến 8 ngày, mệt mỏi, bỏ ăn.

- Vàng da.

- Chảy nước mắt.

- Gia súc cho sữa mất sữa đột ngột và có hiện tượng viêm vú.

- Mủ chảy ra từ khoang mũi (dê, cừu).

- Thiếu máu và đái ra huyết sắc tố, đặc biệt ở gia súc non.

5.1.2.1.2 Chó

- Sốt từ 40 0C đến 41 0C, trước khi chó chết thân nhiệt hạ xuống 36 0C đến 36,5 0C. 

- Ủ rũ, nôn mửa, run rẩy, viêm não, tiêu chảy, trong phân có lẫn máu.

- Vàng da nặng, niêm mạc xuất huyết.

- Bệnh kéo dài từ 2 ngày đến12 ngày.

- Tỷ lệ chết có thể lên tới 50 %.

5.1.2.1.3 Lợn

- Sốt, bỏ ăn bất thường hoặc ăn ít, mệt mỏi, thích nằm ở xó chuồng.

- Phù nề, đầu to, mắt híp.

- Tiếng kêu yếu, khản đặc hay mất hẳn, lông dựng.

- Nước tiểu vàng, hơi sánh, có thể có màu cà phê.

- Niêm mạc và da vàng, lợn bị bệnh nặng da toàn thân có màu vàng.

- Mắt đau có dử, có khi mù mắt.

- Lợn nái có chửa: sảy thai hàng loạt, đẻ ra lợn con gầy còm, ốm yếu.

- Lợn nái sau khi sảy thai từ 3 tuần đến 6 tuần thường chịu đực mà không có biểu hiện chung của động dục.

5.1.2.2 Thể mãn tính

- Gia súc sốt nhẹ từ 39 0C đến 39,5 0C.

- Gia súc cái có chửa có hiện tượng: sảy thai, đẻ non, bất dục; nếu sinh con thì con non đẻ ra yếu.

- Gia súc đực có hiện tượng: viêm khớp, sưng dịch hoàn, tinh dịch loãng, tỷ lệ tinh trùng dị hình cao.

5.1.3 Bệnh tích đại thể

Tùy từng loài gia súc diễn biến của bệnh và thể hiện lâm sàng khác nhau, nhưng nói chung là các loài có biểu hiện vàng da. Gia súc (lợn) bị bệnh nặng khi mổ ra có mùi khét; tổ chức liên kết dưới da vàng, keo nhầy và thủy thũng, mỡ vàng, dịch trong xoang ngực và xoang bụng vàng, máu loãng, xuất huyết dưới da nhiều, xuất huyết niêm mạc ruột, phổi, tim, thận và lách. Nhìn chung các loài gia súc có bệnh tích như sau :

- Phổi thủy thũng, trong phế quản và phế nang có tích nhiều nước màu vàng.

- Mỡ vành tim vàng.

- Bàng quang căng, niêm mạc xuất huyết nặng, chứa đầy nước tiểu màu vàng, đỏ hoặc đỏ xẫm. Cũng có khi bàng quang xẹp, không chứa nước tiểu.

- Gan sưng, vàng, nát.

- Túi mật phần lớn teo, dịch mật sánh lại như kẹo mạch nha. Cũng có trường hợp túi mật căng.

- Hạch lâm ba ruột sưng, thủy thũng. Bệnh nặng màng treo ruột thoái hóa biến thành tổ chức nhầy có màu vàng.

- Thận nhạt màu hoặc có màu vàng lẫn xẫm, có thể có những điểm hoại tử trắng hoặc những điểm xuất huyết nhỏ trên bề mặt của quả thận.

- Bào thai bị sảy có các điểm hoại tử như đầu đinh ghim trên gan, dịch trong cơ thể có màu vàng.

5.1.4 Chẩn đoán phân biệt

- Bệnh sảy thai truyền nhiễm

- Bệnh nhiễm parvovirus

- Bệnh giả dại (bệnh Aujeszky)

- Bệnh dịch tả lợn.

- Hội chứng ngộ độc Aflatoxin.

5.2. Lấy mẫu và bảo quản mẫu

5.2.1 Lấy mẫu

5.2.1.1 Gia súc mới chết

Mổ lấy máu tim, nhau thai, nước tiểu trong bàng quang, thận, các hạch lâm ba. Các tổ chức được lấy một cách vô trùng và không lấy sau khi gia súc chết từ 2 h đến 3 h.

5.2.1.2 Gia súc sống

Máu: lấy máu tĩnh mạch và lấy vào buổi sáng trước khi cho gia súc ăn. Nước tiểu: lấy trong giai đoạn hết sốt.

5.2.2 Bảo quản và vận chuyển

Mẫu huyết thanh gửi đi xét nghiệm phải được bảo quản trong thùng lạnh ở nhiệt độ 4 0C và vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm càng nhanh càng tốt. Bệnh phẩm là phủ tạng, máu và nước tiểu để nuôi cấy phân lập phải bảo quản trong môi trường vận chuyển. Tốt nhất là vận chuyển ngay trong ngày ấy mẫu.

Gửi kèm theo biên bản mổ khám (nếu có).

5.3 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

5.3.1 Chẩn đoán huyết thanh học

5.3.1.1 Nguyên tắc

Phản ứng huyết thanh học dùng trong chẩn đoán bệnh xoắn khuẩn là phản ứng ngưng kết trên phiến kính (phản ứng MAT - Microscopic Agglutination Test) với bộ kháng nguyên sống gồm 15 chủng xoắn khuẩn lưu hành ở Việt Nam.

5.3.1.2 Chuẩn bị

Kháng nguyên chuẩn, kháng huyết thanh chuẩn, huyết thanh kiểm tra và dung dịch muối đệm phosphat phải để ở nhiệt độ phòng khoảng 1 h trước khi làm phản ứng.

5.3.1.3 Cách tiến hành

Bước 1: Cho 4,90 ml (4900 l) dung dịch muối đệm phosphat (PBS) vào 1 ống nghiệm vô trùng.

Bước 2: Cho 0,10 ml (100 l) huyết thanh cần kiểm tra vào và trộn đều, được dung dịch pha loãng 1/50.

Bước 3: Mỗi một mẫu sử dụng 5 lam kính (được lau sạch và đốt trên ngọn lửa đèn cồn), dùng bút chì viết kính chia mỗi lam kính thành 3 ô bằng nhau.

Bước 4: Nhỏ vào mỗi ô một giọt huyết thanh đã pha loãng 1/50 (tương đương với 0,03 ml hay 30 µl)

Bước 5: Nhỏ một giọt kháng nguyên vào các ô tương ứng theo trình tự từ chủng số 1 tới chủng số 15 và trộn đều.

Bước 6: Để 30 min ở nhiệt độ phòng.

Bước 7: Đọc kết quả tuỳ mức độ ngưng kết giữa kháng nguyên và kháng thể mà đánh giá phản ứng là +, ++, +++ hay ++++.

- Phản ứng được đánh giá là dương tính nếu như tại hiệu giá pha loãng 1/100 hoặc lớn hơn, mẫu huyết thanh đó có chứa một lượng kháng thể gây ngưng kết ít nhất 50 % xoắn khuẩn (phản ứng ở mức ++).

- Nếu phản ứng ở mức +++ hay ++++, khi đó ta phải nâng hiệu giá pha loãng của mẫu bắt đầu từ hiệu giá pha loãng 1/100 cho tới 1/12 800.

- Ở nồng độ huyết thanh pha loãng nào vẫn gây ngưng kết 50 % xoắn khuẩn thì ta có thể kết luận mẫu huyết thanh kiểm tra cho kết quả dương tính ở hiệu giá đó.

- Phản ứng âm tính là phản ứng mà tại đó xoắn khuẩn vẫn hoạt động bình thường, có thể có nhiều cụm ngưng kết nhưng dưới 50 % xoắn khuẩn ngưng kết.

5.3.1.4 Đánh giá kết quả

++++: Có hơn 30 cụm ngưng kết hình sao trên vi trường, 100 % xoắn khuẩn ngưng kết và không còn xoắn khuẩn tự do.

+++: Có từ 20 cụm đến 30 cụm ngưng kết hình sao trên vi trường, 75 % xoắn khuẩn ngưng kết và 25 % xoắn khuẩn tự do.

++: Có từ 6 cụm đến 12 cụm ngưng kết, 50 % xoắn khuẩn ngưng kết và 50 % xoắn khuẩn tự do.

+: Có từ 3 cụm đến 5 cụm ngưng kết, nhiều xoắn khuẩn tự do, 25 % xoắn khuẩn ngưng kết và 75 % xoắn khuẩn tự do.

Phản ứng (-): Không có ngưng kết, 100 % xoắn khuẩn tự do.

CHÚ Ý: Có một mẫu đối chứng âm (dùng dung dịch muối đệm phosphat) và một mẫu đối chứng dương (dùng kháng huyết thanh chuẩn).

5.3.2 Chẩn đoán vi khuẩn học

5.3.2.1 Kiểm tra hình thái học

Mẫu máu: trộn với 5 % chất chống đông (natri xitrat), để lắng rồi dùng pipet hút lớp dịch ở trên nhỏ lên phiến kính kiểm tra và soi bằng kính hiển vi tụ quang nền đen.

Đối với mẫu nước tiểu: lấy cặn ở phía dưới đáy ống nghiệm phết kính, soi bằng kính hiển vi tụ quang nền đen tìm xoắn khuẩn. Mẫu phải xem ngay không được để quá 12 h.

Đối với mẫu là phủ tạng là gan, lách, thận không nên lấy sau khi gia súc chết từ 2 h đến 3 h. Nghiền phủ tạng với nước sinh lý theo tỷ lệ 1/10, đem li tâm lấy phần trên soi tươi.

Quan sát dưới kính hiển vi tụ quang nền đen thấy: xoắn khuẩn vận động.

5.3.2.1 Phân lập vi khuẩn

5.3.2.1.1 Cấy chuyển trong môi trường

Máu và nước tiểu, các tổ chức (sau khi nghiền hoặc li tâm) được nuôi cấy trong môi trường vận chuyển (A.3) hoặc môi trường lỏng EMJH (A.1), môi trường bán cố thể Fletcher (A.2) ở 28 0C đến 30 0C. Cấy chuyển liên tục hàng ngày và kiểm tra trên kính hiển vi trong vòng từ 2 tuần đến 6 tuần.

5.3.2.1.2 Tiêm truyền động vật thí nghiệm

Nếu có xoắn khuẩn mọc trong các môi trường nuôi cấy, mật độ canh trùng đạt 2 x 108 hoặc hơn sẽ được tiêm truyền cho chuột lang, sau đó lấy máu tim chuột lang và nuôi cấy lại vào môi trường để lọc tạp khuẩn và thuần khiết, ít nhất sau 2 tháng, nếu không thấy xoắn khuẩn mọc thì ta có thể loại bỏ.

Một phần mẫu bệnh phẩm đem nghiền với nước sinh lý theo tỷ lệ 1/10, lấy huyễn dịch đó tiêm cho chuột lang 2 ml/con. Sau 1, 2, 6, 12, 24 h, lấy máu cấy vào môi trường EMJH.

5.3.2.1.3 Định typ huyết thanh

Sau khi đã phân lập được xoắn khuẩn tiến hành định typ, quy trình định typ được tiến hành bằng phản ứng ngưng kết trên phiến kính với cả 15 mẫu kháng huyết thanh đơn giá dương tính chuẩn của 15 chủng. Mẫu kháng huyết thanh nào cho phản ứng ngưng kết mạnh nhất thì chủng xoắn khuẩn này thuộc vào nhóm đó. Còn mẫu kháng huyết thanh nào mà cũng cho phản ứng ngưng kết nhưng yếu hơn thì đó chỉ là hiện tượng ngưng kết chéo giữa chủng này với kháng huyết thanh chuẩn của các chủng khác.

6. Kết luận bệnh

Kết hợp triệu chứng lâm sàng, bệnh tích và mẫu bệnh phẩm sau khi tiến hành phân lập và định typ, xác định được chủng xoắn khuẩn gây bệnh thì kết luận dương tính.

Đối với đàn chưa tiêm phòng: kết quả xét nghiệm huyết thanh bằng phản ứng ngưng kết kháng nguyên kháng thể đạt 50 % ở hiệu giá pha loãng huyết thanh 1/100 trở lên thì kết luận dương tính.

Đối gia súc đã được tiêm phòng:

- Mẫu huyết thanh nào cho phản ứng ngưng kết kháng nguyên kháng thể đạt 50 % ở hiệu giá pha loãng huyết thanh 1/200 trở lên thì kết luận dương tính.

- Mẫu huyết thanh nào cho phản ứng ngưng kết kháng nguyên kháng thể đạt 50 % ở hiệu giá pha loãng huyết thanh 1/100, nhưng có các triệu chứng lâm sàng và bệnh tích điển hình của bệnh thì kết luận dương tính.

PHỤ LỤC A

(Quy định)

THÀNH PHẦN VÀ CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG VÀ DUNG DỊCH THUỐC THỬ

A.1 Môi trường lỏng EMJH (Ellinghausen và McCullough; Johnson và Harris)

Môi trường cơ bản EMJH Bacto - Leptospira có bổ sung Enrichment Bacto - Leptospira được dùng để nuôi cấy và giữ giống xoắn khuẩn. Môi trường cơ bản và Enrichment được chuẩn bị theo công thức chế tạo của Ellinghausen vàMcCullough và được sửa đổi bởi Johnson và Harris.

Thành phần môi trường cơ bản:

Dinatri hydrophosphat (Na2HPO4)                                                   1 g

Kali dihydrophosphat (K2HPO4)                                                       0,3 g

Natri clorua (NaCl)                                                                           1 g

NH4Cl                                                                                                0,25 g

Vitamin B1                                                                                        0,5 g

Hoà tan 2,3 g môi trường cơ bản vào trong 900 ml nước. Hấp vô trùng ở 121 oC trong 15 min. Sau đó để nguội ở nhiệt độ phòng, bổ sung thêm dung dịch Enrichment (900 ml môi trường EMJH cơ bản + 100 ml dung dịch Enrichment). Trộn đều, điều chỉnh pH 7,5 bằng dung dịch NaOH 1 N hoặc dung dịch HCl 1 N. Đem chia ra các ống nhỏ để ở nhiệt độ phòng kiểm tra vô trùng.

Chuẩn bị dung dịch Enrichment:

Dung dịch 1:

FeSO4.7H2O                                                                 5 g

Nước vừa đủ                                                                 1000 ml

Dung dịch 2:

CaCl2.2H2O                                                                 20 g

MgCl2.6H2O                                                                 20 g

Nước vừa đủ                                                                1000 ml

Dung dịch 3:

Vitamin B12                                                                  0,2 g

Nước vừa đủ                                                                1000 ml

Dung dịch 4:

Hoà tan 200 ml Tween 80 vào trong 1000 ml nước.

Dung dịch 5:

ZnSO4.7H2O                                                                 4 g

Nước vừa đủ                                                                1000 ml

Dung dịch 6:

Vitamin B1                                                                    10 g

Nước vừa đủ                                                                1000 ml

Dung dịch 7:

10 g bột Bovine albumin serum (BSA) hòa tan trong 66 ml nước, cho vào máy khuấy từ khuấy đều cho tan ở nhiệt độ 4oC.

Lần lượt cho các dung dịch trên với số lượng như sau: 10 ml dung dịch 1; 1 ml dung dịch 2; 1 ml dung dịch 3; 6,25 ml dung dịch 4; 1 ml dung dịch 5; 0,5 ml dung dịch 6; dung dịch 7, cho nước vừa đủ tới 100 ml.

Lắc đều và đem lọc qua màng lọc millipore.

A.2 Môi trường bán cố thể Fletcher

Cho 2 g thạch vào 900 ml môi trường EMJH cơ bản, đem hấp ở 121 0C trong 20 min cho thạch tan hoàn toàn, để nguội xuống còn 50 0C, cho 100 ml Enrichment vào và lắc đều, chỉnh pH 7,5 và chia ra các ống nghiệm, mỗi ống khoảng 5 ml.

Tất cả các thao tác pha chế hoặc chia ống môi trường phải được tiến hành trong buồng cấy vô trùng.

A.3 Môi trường vận chuyển, pH 7,6

Pha Bovine Albumine Serum (BSA) với dung dịch PBS (A.4) thành dung dịch BSA 1 %. 

Bổ sung 5-Fluoro-uracil với lượng từ 100 g đến 200 g cho mỗi mililit môi trường.

A.4 Dung dịch muối đệm phosphat (PBS)

A.4.1 Dung dịch đậm đặc 10 lần:

Na2HPO4 khan                                                                     12,36 g

NaH2PO4.H2O                                                                     1,80 g

NaCl                                                                                     85,00 g

Nước vừa đủ                                                                        1000 ml

A.4.2    Dung dịch dùng trong phản ứng ngưng kết trên phiến kính PBS 0,01 M, pH 7,6

Dung dịch đậm đặc (A.4.1)                                                  100 ml

Nước vừa đủ     1000 ml

PHỤ LỤC B

(Quy định)

BỘ KHÁNG NGUYÊN DÙNG ĐỂ CHẨN ĐOÁN BỆNH XOẮN KHUẨN DO LEPTOSPIRA

1. Leptospira australis australis Ballico

2. L. autumnalis autumnaliss Akiyami A

3. L. bataviae bataviae Van Tienen

4. L. canicola canicola Hond Utrech IV

5. L. gippotyphosa gippotyphosa Moskva V

6. L. hebdomadis hebdomadis Hebdomadis

7. L. icterohaemorrhagiae icterohaemorrhagiae Verdun

8. L. javanica javanica Veldrat Bataviae 46

9. L. panama panama

10. L. pomona pomona Pomona

11. L. pyrogenes

12. L. sejroe-hardjo Hardjo Bovis

13. L. sejroe saxkoebing

14. L. semaranga

15. L. tarassovi tarassovi Mitis Johnson