TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 8400-5:2011

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHUẨN ĐOÁN - PHẦN 5: BỆNH TIÊN MAO TRÙNG

Animal disease - Diagnostic procedure - Part 5: trypanosomosis disease

Lời nói đầu

TCVN 8400-5:2011 được chuyển đổi từ 10 TCN 821:2006 thành tiêu chuẩn quốc gia theo quy định tại khoản 1 Điều 69 của Luật Tiêu chuẩn và Quy chuẩn kỹ thuật và điểm a khoản 1 Điều 7 Nghị định số 127/2007/NĐ-CP ngày 01/8/2007 của Chính phủ quy định chi tiết thi hành một số điều của Luật Tiêu chuẩn và Quy chuẩn kỹ thuật;

TCVN 8400-5:2011 do Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 5: BỆNH TIÊN MAO TRÙNG

Animal disease - Diagnostic procedure - Part 5: Trypanosomosis disease

1. Phạm vi áp dụng

Quy trình này quy định quy trình chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trên động vật như trâu, bò, lợn, ngựa, đê, cừu, chó mèo…

2. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

Bệnh tiên mao trùng (trypanosomosis disease)

Bệnh ký sinh trùng đường máu gây ra bởi giống Trypanosoma sp.

CHÚ THÍCH: Bệnh không lây trực tiếp từ con vật ốm sang con vật lành mà do các loại ruồi trâu và mòng hút máu truyền bệnh. Các loài động vật mắc bệnh là trâu, bò, lợn, ngựa, dê, cừu, chó mèo… Ở Việt Nam, mới chỉ xác định được loài Trypanosoma evansi gây bệnh cho động vật như trâu, bò, lợn, ngựa.

3. Thuốc thử

Trong tiêu chuẩn này chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác.

- Cồn 70^o

- Metanol

- Giemsa

- Natri xitrat 3,8%

4. Thiết bị, dụng cụ

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

- Bông

- Kéo

- Kim tiêm

- Kính hiển vi

- Lamen

- Máy li tâm

- Ống hematocrit

- Ống nghiệm

- Phiến kính

- Xiranh.

5. Quy trình chẩn đoán

5.1. Chẩn đoán lâm sàng

5.1.1. Đặc điểm dịch tễ

Bệnh tiên mao trùng có thể gặp hầu hết các vật nuôi như trâu, ngựa, bò, lợn, cừu, dê, chó và mèo.

Bệnh thường xảy ra ở vùng núi và trung du, bệnh thường ít xảy ra ở đồng bằng.

Bệnh thường xảy ra khi thời tiết khắc nghiệt, thức ăn khan hiếm vào thời gian từ tháng 10 đến tháng 4 (vụ đông xuân, do vậy bệnh còn gọi là bệnh “đổ ngã vụ đông xuân”).

5.1.2. Triệu chứng lâm sàng

5.1.2.1. Thể cấp tính

Con vật mắc bệnh sốt cao từ 40^oC đến 41^oC; sốt theo chu kỳ còn gọi là sốt hồi quy; mắt sưng, đỏ tía; khi con vật sốt cao thường thể hiện triệu chứng thần kinh: quay cuồng, đi vòng tròn, chân run rẩy… Con vật có thể chết.

Nếu con vật không chết sẽ chuyển sang thể mạn tính mang trùng.

5.1.2.2. Thể mạn tính

Sốt cách nhật: sốt từ 40^oC đến 41^oC trong 2 ngày đến 3 ngày, sau đó nghỉ từ 4 ngày đến 6 ngày;

Con vật gầy, da khô; con vật bị thiếu máu và suy nhược;

Biểu hiện thủy thũng ở những vùng thấp, da mỏng; nhiều khi mí mắt cũng bị thủy thũng;

Con vật chảy nước mắt và mắt có nhiều dử đặc như keo;

Con vật mang thai có thể bị sảy thai;

Ở thể này, con vật có thể chết hoặc không.

5.1.3. Bệnh tích

Xác động vật gầy gò. Niêm mạc mắt tụ máu màu đỏ tía hoặc màu vàng sẫm hay nhạt, niêm mạc miệng, âm đạo có màu vàng. Thủy thũng ở vùng thấp như hầu, ức, nách, chân, háng, những chỗ thủy thũng chứa chất nhày như keo, máu loãng có màu hồng;

Mổ khám thấy: thịt gia súc nhão, mỡ màu vàng thẫm; tim, phổi, lách đều sưng và tụ máu; hạch lympho sưng; xoang ngực, xoang bụng, bao tim tích nước màu vàng; những chỗ thủy thủng chứa chất nhầy như keo.

5.2. Chẩn đoán phòng thí nghiệm

5.2.1. Lấy mẫu

Dùng bông tẩm cồn, sát trùng vị trí lấy mẫu.

Dùng bơm kim tiêm chích vào tĩnh mạch rìa tai, tĩnh mạch cổ, hoặc tĩnh mạch đuôi của động vật và hút máu ra.

Mẫu bệnh phẩm sau khi lấy ghi rõ các nội dung; tên chủ gia súc, địa điểm lấy mẫu, thời gian lấy mẫu, loại gia súc, tuổi, tinh biệt; các triệu chứng lâm sàng, bệnh tích.

Mẫu lấy xong, phải được giữ trong lạnh từ 2^oC đến 8^oC và gửi về phòng thí nghiệm trong 24h.

CHÚ Ý: Lấy mẫu khi con vật sốt thì khả năng tìm thấy tiên mao trùng trong máu cao hơn so với bình thường.

5.2.2. Phát hiện tiên mao trùng

5.2.2.1. Yêu cầu chung

Phát hiện mầm bệnh (Trypanosoma evansi) trong máu của động vật đang nhiễm bệnh.

5.2.2.2. Phương pháp tiêu bản màu dàn mỏng nhuộm Giemsa

5.2.2.2.1. Nguyên tắc

Dựa vào hình dạng của tiên mao trùng trong máu, tính chất bắt màu và thuốc nhuộm Giemsa của tiên mao trùng, các thành phần hữu hình của máu.

5.2.2.2.2. Lấy mẫu

Nhỏ một giọt máu chống đông (khoảng 20 ml) lên phần đầu của một phiến kính sạch.

Dùng phiến kính khác đặt nghiêng góc từ 30^o đến 45^o; đẩy nhanh về đầu kia của phiến kính, để khô tự nhiên. Đặt tiêu bản lên khay.

5.2.2.2.3. Các bước tiến hành

Nhỏ cồn metanol để cố định tiêu bản, để khô tự nhiên.

Nhỏ thuốc nhuộm Giemsa, để trong 1 h.

Lấy tiêu bản ra, rửa dưới vòi nước chảy, để khô tự nhiên.

Kiểm tra dưới kính hiển vi độ phóng đại 1000 lần.

5.2.2.2.4. Đọc kết quả

Dương tính khi tìm thấy tiên mao trùng bắt màu xanh lơ, nguyên sinh chất bắt màu tím hoặc xanh thẫm. Tiên mao trùng có một nhân chính và một nhân phụ, roi… Hồng cầu bắt màu hồng đều. Bạch cầu nhân bắt màu sẫm.

5.2.2.3. Phương pháp tập trung Haematocrit

5.2.2.3.1. Nguyên tắc

Dựa vào trọng lượng của tiên mao trùng trong máu, khả năng sống của chúng khi được giữ trong điều kiện chất bảo quản và nhiệt độ thích hợp.

5.2.2.3.2. Lấy mẫu

Lấy 70 ml máu cho vào hai ống thủy tinh kích thước 75 mm x 1,5 mm.

5.2.2.3.3. Các bước tiến hành

Bịt một đầu ống thủy tinh bằng matit.

Đặt ống thủy tinh vào máy ly tâm chuyên dụng Hematocrit với nguyên tắc đầu bịt kín theo chiều ra ngoài. Sau đó lý tâm với tốc độ 3000 r/min trong 10 min.

Lấy ống thủy tinh ra ngoài. Bẻ phần tiếp giáp giữa huyết thanh và dung dịch vàng sẫm phía dưới. Đổ dung dịch vào phiến kính.

Đặt lamen lên phía trên phiến kính, xem ở độ phóng đại từ 100 lần đến 200 lần.

CHÚ THÍCH: Phương pháp này có thể xác định khoảng 400 tiên mao trùng/ml máu; Có thể nhỏ dầu soi kính lên giữa 2 phần được tách biệt trên ống Haematocrit để đảm bảo tiếp giáp giữa vật kính và dầu soi kính.

5.2.2.3.4. Đọc kết quả

Dương tính khi thấy Tiên mao trùng tập trung và di động.

5.2.2.4. Phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm

5.2.2.4.1. Nguyên tắc

Tiên mao trùng có khả năng sống, nhân lên trong động vật thí nghiệm mẫn cảm như chuột nhắt trắng, chuột lang, thỏ.

5.2.2.4.2. Lấy mẫu

Lấy 0,2 ml máu chống đông đối với động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng.

Lấy 0,5 ml máu chống đông đối với động vật thí nghiệm là chuột lang, chuột cống trắng hoặc thỏ.

5.2.2.4.3. Các bước tiến hành

Đối với chuột nhắt trắng, chuột lang, chuột cống trắng: tiêm vào xoang phúc mạc; đối với thỏ: tiêm truyền tĩnh mạch rìa tai.

Sau từ 24h đến 48 h, lấy máu đuôi chuột kiểm tra tiên mao trùng (soi tươi).

Kiểm tra chuột trong vòng từ 1 tuần đến 2 tuần.

CHÚ THÍCH: Khi làm nhiều mẫu phải đánh dấu chuột bằng phương pháp cắt lông.

5.2.2.4.4. Đọc kết quả

Dương tính khi thấy tiên mao trùng di động trong huyết tương.

5.2.2.5. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

5.2.2.5.1. Nguyên tắc

Phương pháp sinh học phân tử được sử dụng để phát hiện đoạn gen đặc hiệu của tiên mao trùng bằng cách khuyếch đại giai đoạn gen đó lên nhờ bộ kit và Primer đặc hiệu.

5.2.2.5.2. Lấy mẫu

Lấy mẫu máu tĩnh mạch cổ hoặc tai gia súc cho vào ống nghiệm có chất chống đông.

5.2.2.5.3. Các bước tiến hành

Tách chiết DNA của tiên mao trùng từ máu gia súc dùng KIT chiết tách thực hiện quy trình theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Chu trình nhiệt để nhân DNA bằng PCR.

Chạy điện di: Chạy điện di trên agarose gel với nồng độ 1,5% trong dung dịch đệm TAE hoặc TBE.

Nhuộm bản gel. Soi bản gel và chụp ảnh.

CHÚ THÍCH: Có thể dùng bộ kit phát hiện tiên mao trùng của các hãng khác nếu cho kết quả tương đương.

5.2.2.5.4. Đọc kết quả

Phản ứng dương tính khi:

- Mẫu đối chứng dương có một vạch duy nhất đúng kích cỡ của sản phẩm;

- Mẫu đối chứng âm: không xuất hiện vạch;

- Mẫu kiểm tra có vạch giống mẫu đối chứng dương.

5.2.3. Phát hiện kháng thể tiên mao trùng

5.2.3.1. Nguyên tắc

Phát hiện kháng thể tiên mao trùng bằng phương pháp ngưng kết trực tiếp trên phiến kính. Phản ứng ngưng kết xảy ra khi tiên mao trùng gặp kháng thể tương ứng có trong huyết thanh gia súc cần chẩn đoán thì sẽ co cụm lại.

5.2.3.2. Các bước tiến hành

Nhỏ một giọt natri xitrat 3,8 % và một giọt kháng nguyên sống lên phiến kính sạch.

Nhỏ huyết thanh nghi ngờ lên, trộn đều, đậy lamen, để từ 5 min đến 10 min.

Kiểm tra dưới kính hiển vi độ phóng đại 100 hoặc 200 lần.

5.2.3.3. Đọc kết quả

Dương tính khi thấy tiên mao trùng chụm lại như hình hoa cúc.

CHÚ THÍCH: Các phương pháp phát hiện kháng thể (IFAT, ELISA…) do chi phí cao nên thường dùng trong điều tra huy thanh học.

6. Kết luận bệnh

Động vật được xác định mắc bệnh tiên mao trùng khi có các đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng của bệnh tiên mao trùng và kết quả dương tính với một trong những phương pháp xét nghiệm sau:

Phương pháp Haematocrit: Tiên mao trùng tập trung và di động.

Phương pháp tiêu bản máu dàn mỏng nhuộm Giemsa: Tiên mao trùng bắt màu xanh lơ, nguyên sinh chất bắt màu tím hoặc xanh thẫm. Tiên mao trùng có một nhân chính và một nhân phụ, roi.

Phương pháp ngưng kết trực tiếp trên phiến kính: Tiên mao trùng chụm lại như hình hoa cúc.

Phương pháp PCR: mẫu kiểm tra có vạch giống mẫu đối chứng dương.

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] OIE, 2009, Trypanosoma Evansi Infections (Including Surra). Aetiology Epidemiology

[2] Diagnosis Prevention and Control References

[3] OIE, 2004, SURRA, Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals

[4] Phan Lục, 1997, Giáo trình ký sinh trùng và bệnh ký sinh trùng

[5] JICA, Quy trình chẩn đoán bệnh.