TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 8542 : 2010

THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG BACITRACIN KẼM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Animal feeding stuff - Determination of zinc bacitracin content by high-perfomance liquid chromatographic method

Lời nói đầu

TCVN 8542:2010 được chuyển đổi từ 10TCN 834:2006 thành Tiêu chuẩn Quốc gia theo quy định tại khoản 1 Điều 69 của Luật Tiêu chuẩn và Quy chuẩn Kỹ thuật và điểm a khoản 1 Điều 6 Nghị định số 127/2007/NĐ-CP ngày 1/8/2007 của Chính phủ quy định chi tiết thi hành một số điều của Luật Tiêu chuẩn và Quy chuẩn kỹ thuật;

TCVN 8542:2010 do Cục chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG BACITRACIN KẼM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Animal feeding stuff - Determination of zinc bacitracin content by high-perfomance liquid chromatographic method

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng kháng sinh bacitracin kẽm (Zn-bacitracin) trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Giới hạn định lượng của phương pháp là 5 mg/kg.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau đây rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 6952:2011 (ISO 6498:1998) Thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử.

3. Nguyên tắc

Zn-bacitracin trong mẫu thức ăn chăn nuôi được chiết bằng dung dịch đệm phosphat 0,5 M, pH 2, điều chỉnh dịch chiết thu được đến pH 8,0, chiết pha lỏng-lỏng với etyl axetat, sau đó dịch chiết được làm sạch trên cột chiết pha rắn C18 và phân tích trên hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao với detector UV ở bước sóng 254 nm.

4. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác.

4.1. Nước dùng cho HPLC, hoặc tương đương.

4.2. Axetonitril, loại dùng cho HPLC.

4.3. Metanol, loại dùng cho HPLC.

4.4. Etyl axetat, loại dùng cho HPLC.

4.5. Diclometan, loại dùng cho HPLC.

4.6. Natri sulfit (Na₂SO₃).

4.7. Dung dịch natri hydroxit (NaOH), 0,1 M

Hòa tan 0,4 g Natri hydroxit trong 100 ml nước.

4.8. Dung dịch đệm phosphat

4.8.1. Dung dịch đệm phosphat, nồng độ 0,06 M, pH 8

Hòa tan 9,08 g kali dihydrophosphat (KH₂PO₄) bằng nước trong bình định mức một vạch 1 000ml và thêm nước đến vạch mức, trộn đều (dung dịch I).

Hòa tan 11,88 g natri hydrophosphat ngậm hai phân tử nước (Na₂HPO₄.2H₂O) bằng nước vào bình định mức một vạch 1 000 ml và thêm nước đến vạch mức, trộn đều (dung dịch II).

Trộn 5,5 ml dung dịch I và 94,5 ml dung dịch II để được 100 ml dung dịch đệm phosphat 0,06 M, pH 8,0.

4.8.2. Dung dịch đệm phosphat, 0,3 M, pH 2

Hòa tan 40,8 g kali dihydrophosphat bằng 900 ml nước. Chỉnh pH đến 2 bằng axit o-phosphoric 85 %. Thêm nước đến 1 000 ml.

4.8.3. Dung dịch đệm phosphat, 0,3 M, pH 3

Pha dung dịch đệm phosphat 0,3 M như trong 4.8.2 và điều chỉnh pH đến 3 bằng axit o-phosphoric 85 %. Thêm nước đến 1 000 ml.

4.9. Pha động

4.9.1. Dung môi A: dung dịch đệm phosphat 0,3 M, pH 3 (4.8.3) có chứa natri dodexyl sulfat (C₁₂H₂₅O₄SNa) nồng độ 20 mM (5,76 g trong 1 000 ml dung dịch đệm phosphat 0,3 M).

4.9.2. Dung môi B: hỗn hợp axetonitril (4.2): metanol (4.3) với tỷ lệ 19 : 1 (phần thể tích).

4.9.3. Pha động HPLC được chuẩn bị bằng cách trộn dung môi A và dung môi B với tỷ lệ 50 : 50 (phần thể tích). Sau đó lọc hỗn hợp dung dịch thu được qua màng lọc 0,45 mm, siêu âm đuổi khí trong 30 min.

4.10. Dung dịch chuẩn

4.10.1. Dung dịch chuẩn gốc, 1 000 mg/ml

Cân 28 mg chất chuẩn Zn-bacitracin, chính xác đến 0,1 mg, vào bình định mức 25 ml (lượng cân được điều chỉnh theo hàm lượng Zn-bacitracin), hòa tan và định mức bằng dung dịch đệm phosphat 0,3 M, pH 3.

Các dung dịch chuẩn gốc được bảo quản trong lọ sẫm màu ở 4 ^oC, có thể bền được trong 1 tuần.

4.10.2. Dãy dung dịch chuẩn phân tích sắc kí, 200 mg/ml, 400 mg/ml, 500 mg/ml và 1 000 mg/ml

Lấy chính xác lần lượt 2 ml, 4 ml, 5 ml và 10 ml dung dịch chuẩn gốc 1 000 mg/ml (4.10.1) cho vào các bình định mức dung tích 10 ml, pha loãng và định mức đến vạch bằng dung dịch đệm phosphat 0,3 M, pH 3 (4.8.3), thu được dung dịch có nồng độ tương ứng 200 mg/ml, 400 mg/ml, 500 mg/ml và 1 000 mg/ml.

Chuẩn bị dung dịch trong ngày sử dụng.

CHÚ THÍCH: Nếu sau khi pha 3 h mà chưa sử dụng, thì bảo quản các dung dịch chuẩn này ở 4^oC. Tốt nhất là pha các dung dịch chuẩn này và bảo quản ở 4^oC ít nhất 30 min trước khi phân tích và chỉ đưa ra ngay trước khi chạy sắc kí.

5. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và các thiết bị, dụng cụ cụ thể sau:

5.1. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.

5.2. Cân, có thể cân chính xác đến 0,01 g.

5.3. Máy li tâm, tốc độ 3 000 r/min có ống li tâm dung tích 50 ml.

5.4. Ống li tâm, dung tích 50 ml bằng polypropylen hoặc bằng thủy tinh, có nắp đậy.

5.5. Máy lắc tròn hoặc máy lắc ngang có thể đạt tốc độ 250 r/min.

5.6. Máy đo pH, có thể đo chính xác đến 0,05 đơn vị.

5.7. Bình định mức, dung tích 10 ml, 100 ml và 1 000 ml.

5.8. Pipet tự động, có thể điều chỉnh được từ 1 ml đến 10 ml.

5.9. Micropipet, dung tích từ 10 ml đén 100 ml và từ 200 ml đến 1 000 ml.

5.10. Pipet tự động, dung tích 2 ml, 10 ml và 20 ml.

5.11. Rây, có kích thước lỗ 1 mm.

5.12. Ống đong, dung tích 1 000 ml.

5.13. Bình nón, dung tích 125 ml, có nắp thủy tinh.

5.14. Bể siêu âm.

5.15. Bơm hút chân không.

5.16. Cột chiết pha rắn C18, loại 500 mg/3 ml.

5.17. Màng lọc, có cỡ lỗ 0,45 mm.

5.18 Lọ nhỏ dùng cho HPLC, có nắp vặn PTFE.

5.19. Thiết bị trộn mẫu phòng thử nghiệm loại Hobart Model C 100 T hoặc tương đương.

5.20. Ống nghiệm, kích thước 10 mm x 100 mm.

5.21. Thiết bị thổi khí bằng nitơ, dùng để thổi dung môi sử dụng dòng khí nitơ.

5.22. Thiết bị chia mẫu

Thiết bị chia đôi hoặc chia tư mẫu, ví dụ như thiết bị chia tư hình nón, thiết bị chia nhiều ngăn có hệ thống phân hạt hoặc các thiết bị chia khác đảm bảo phân chia mẫu phòng thử nghiệm thành mẫu thử đồng nhất.

5.23. Hộp đựng mẫu, có nắp đậy kín.

5.24. Hệ thống HPLC, gồm có:

5.24.1. Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao.

5.24.2. Bình chứa dung môi.

5.24.3. Hệ thống bơm mẫu.

5.24.4. Detector UV, có thể đo ở bước sóng 254 nm.

5.24.5. Bộ tích phân, hoặc máy tính xử lý dữ liệu.

5.24.6. Cột phân tích HPLC pha đảo, Hypersyl ODS 200 mm x 2,1 mm, cỡ hạt 5 mm hoặc loại tương đương.

5.24.7. Cột bảo vệ, Hypersyl ODS 10 mm x 2,1 mm, cỡ hạt 5 mm hoặc loại tương đương.

6. Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu

6.1. Lấy mẫu

Phương pháp lấy mẫu không được quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002) Thức ăn chăn nuôi - Lấy mẫu [1].

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện, không bị hư hỏng hoặc bị biến đổi chất lượng trong quá trình vận chuyển và bảo quản.

6.2. Chuẩn bị mẫu

Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952:2001 (ISO 6498:1998).

Nghiền mẫu trong phòng thử nghiệm (không nhỏ hơn 500 g) để lọt qua rây có cỡ lỗ 1 mm (5.11). Trộn đều mẫu bằng thiết bị trộn phòng thử nghiệm (5.19) trong thời gian 10 min. Sau đó chia hỗn hợp bằng thiết bị chia đôi hoặc thiết bị chia tư (5.23) đến khi thu được lượng mẫu thử không nhỏ hơn 100 g.

Các mẫu thử được bảo quản trong các hộp đựng mẫu (5.23) ở điều kiện nhiệt độ 2 ^oC đến 25 ^oC, nơi khô.

LƯU Ý: Nên nghiền, trộn mẫu trong phòng có thông gió, nên đeo kính, khẩu trang và găng tay bảo vệ.

7. Cách tiến hành

7.1. Chiết và làm sạch mẫu thử

7.1.1. Chiết mẫu

Cân khoảng 1 g đến 10 g phần mẫu thử đã được chuẩn bị theo 6.2 (tùy theo hàm lượng kháng sinh có trong mẫu), chính xác đến 0,1 mg, cho vào bình nón 125 ml (5.13), thêm từ 10ml đến 15ml dung dịch đệm phosphat 0,3 M, pH 2 (4.8.2). Lắc mạnh bình nón trên máy lắc (5.5) trong thời gian 20 min và thêm 20 mg natri suflit (4.6). Chuyển dịch chiết vào ống li tâm thứ nhất dung tích 50 ml (5.4), đậy nắp và li tâm trong 10 min ở tốc độ 3 000 r/min. Gạn phần dịch trong vào ống li tâm thứ hai. Phần cặn còn lại trong bình nón được rửa thêm hai lần, mỗi lần dùng 5 ml dung dịch đệm phosphat 0,3 M, pH 2 (4.8.2), li tâm và cho tất cả phần dịch chiết vào ống li tâm thứ hai.

7.1.2. Làm sạch

7.1.2.1. Chiết pha lỏng-lỏng

Toàn bộ dịch chiết trong ống li tâm thứ hai (7.1.1) được chỉnh pH đến 8,0 bằng dung dịch natri hydroxit 0,1 M (4.7), li tâm với tốc độ 3 000 r/min trong 5 min. Chuyển phần dịch chiết trong vào ống nghiệm (5.20), phần kết tủa trong ống li tâm thứ hai được xử lý hai lần, mỗi lần dùng 0,5 ml dung dịch đệm phostphat 0,3 M, pH 2 (4.8.2), li tâm với tốc độ 3 000 r/min trong 5 min và gộp các phần dịch chiết vào ống nghiệm nêu trên. Dịch chiết thu được đem chiết lỏng-lỏng ba lần, mỗi lần dùng 3 ml etyl axetat (4.4), loại bỏ lớp etyl axetat sau khi chiết.

7.1.2.2. Chiết pha rắn

Cột SPE (5.16) được hoạt hóa lần lượt bằng 3 ml diclometan (4.5), 5 ml metanol (4.3), 5 ml dung dịch đệm phosphat pH 8 (4.8.1), sau đó chuyển dịch chiết thu được ở 7.1.2.1 qua cột với tốc độ dòng 1 ml/min. Zn-bacitracin được rửa giải bằng 3 ml metanol với tốc độ dòng 1ml/min, dịch rửa giải được cho vào một ống nghiệm khác và cho bay hơi đến khô, sử dụng thiết bị thổi khí bằng nitơ (5.21) ở nhiệt độ không lớn hơn 30 ^oC. Phần còn lại được hòa tan bằng 0,2 ml hỗn hợp gồm dung dịch đệm phosphat (0,3 M, pH 2) : axetonitril (4.2) theo tỷ lệ 70 : 30 (phần thể tích) và lắc đều. Lọc dịch thu được cho qua màng lọc (5.17) vào lọ nhỏ dùng cho HPLC (5.18) để phân tích trên HPLC.

7.2. Chuẩn bị mẫu trắng

Mẫu trắng là mẫu thức ăn chăn nuôi được xác định là không có Zn-bacitracin. Mẫu trắng được chuẩn bị tương tự như mẫu thử theo 7.1.

7.3. Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi

Việc xác định độ thu hồi được thực hiện bằng cách cho một lượng dung dịch chuẩn có nồng độ thích hợp được pha từ dung dịch gốc vào 5 g mẫu trắng (7.2) để đảm bảo mẫu có hàm lượng Zn-bacitracin nằm trong dãy đồ thị chuẩn, mẫu được để yên trong 30 min trước khi tiến hành chiết. Sau đó tiếp tục quá trình chiết mẫu tương tự như đối với mẫu thử theo 7.1.

7.4. Phân tích trên HPLC

7.4.1. Điều kiện sắc kí

Nhiệt độ cột:                 30^oC;

DetectorUV:                  bước sóng 254 nm;

Pha động:                     theo 4.9;

Tốc độ dòng:                0,5 ml/min;

Thể tích bơm mẫu:        10 ml.

7.4.2. Phương pháp xác định

7.4.2.1. Nên sử dụng cột bảo vệ, việc sử dụng cột bảo vệ không có bất cứ ảnh hưởng nào đến kết quả phân tích.

7.4.2.2. Cân bằng hệ thống sắc kí bằng pha động (4.9) trong 30 min trước khi bơm mẫu.

7.4.2.3. Quy trình bơm mẫu theo thứ tự như sau: dịch mẫu trắng, các dung dịch chuẩn, dịch mẫu thu hồi, dịch mẫu thử, các dung dịch chuẩn.

Cần bơm các dịch chuẩn trước và sau mỗi đợt phân tích, không nên để quá 20 lần bơm mẫu cho mỗi đợt phân tích. Nếu quá 20 lần thì phải bơm các dung dịch chuẩn thêm lần nữa vào khoảng giữa đợt bơm mẫu.

7.4.2.4. Xác định diện tích pic Zn-bacitracin của các dung dịch chuẩn và của mẫu thử tương ứng. Tính nồng độ Zn-bacitracin trong mẫu thử dựa vào đường chuẩn.

7.4.2.5. Sau khi chạy máy phải làm sạch hệ thống HPLC bằng hỗn hợp gồm nước : axetonitril (4.2) theo tỷ lệ 40 : 60 (phần thể tích) trong 30 min trước khi tắt máy.

8. Tính kết quả

8.1. Dựng đường chuẩn

8.1.1. Phải đảm bảo rằng các diện tích pic của mẫu thử đều không vượt quá diện tích pic của mẫu chuẩn ở nồng độ lớn nhất, trong trường hợp vượt quá thì tiến hành thử nghiệm lại với độ pha loãng phù hợp.

8.1.2. Xây dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích pic thu được của dung dịch chuẩn với nồng độ của Zn-bacitracin theo quan hệ tuyến tính bậc 1:

y = ax b

Trong đó:

y là diện tích pic (hoặc chiều cao pic);

x là nồng độ của tylosin;

a là hệ số góc;

b là hằng số.

8.2. Tính toán

8.2.1. Hàm lượng Zn-bacitracin có trong mẫu thử, X, tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg), được tính dựa vào đường chuẩn hồi quy tuyến tính (8.1.2) theo công thức sau:

Trong đó:

Y là hiệu số giữa diện tích Zn-bacitracin của dịch chiết mẫu thử và diện tích pic tương ứng của mẫu trắng;

a, b là các thông số của đường chuẩn y = ax b (xem 8.1.2);

V là thể tích dịch chiết mẫu (7.1.2.2), tính bằng mililit (ml);

m là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g).

8.2.2. Kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của hai lần phân tích lặp lại. Giá trị trung bình được làm tròn đến một chữ số thập phân.

8.2.3. Xác định độ thu hồi, R, tính bằng phần trăm (%), theo công thức sau:

Trong đó:

C₁ là hàm lượng Zn-bacitracin xác định được theo quy trình phân tích, tính bằng miligam trên kigogam (mg/kg);

C là hàm lượng Zn-bacitracin được bổ sung vào mẫu, tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg).

Độ thu hồi được xác định cho mỗi lần chạy mẫu phải nằm trong khoảng từ 80% đến 110%.

9. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo kết quả phải bao gồm ít nhất các thông tin dưới đây:

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu đã dùng, nếu biết;

- phương pháp thử đã dùng, cũng như viện dẫn tiêu chuẩn này;

- tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;

- kết quả thử nghiệm thu được.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002), Thức ăn chăn nuôi - Lấy mẫu

[4] AOAC 982.44 Bacitracin in premix feeds. Liquid chromatographic

[5] Capitan-Vallvey. 2002. High-performance liquid chromatography determination of Zn-bacitracin in animal feed by post-column derivatization and fluorescence detection. J. Chromatography. A. 943. 227-234.