Tóm tắt Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8565:2010 về Phân bón vi sinh vật - Phương pháp xác định hoạt tính phân giải phốt phát của vi sinh vật
Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8565:2010 là văn bản kỹ thuật quan trọng quy định phương pháp đánh giá năng lực phân giải các hợp chất phốt phát khó tan của các chủng vi sinh vật sử dụng trong sản xuất phân bón. Dưới đây là nội dung tóm tắt chi tiết về phạm vi áp dụng, tài liệu viện dẫn, thuật ngữ định nghĩa và nguyên lý xác định từ Điều 1 đến Điều 4 của tiêu chuẩn này.
1. Phạm vi áp dụng (Điều 1)
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hoạt tính phân giải phốt phát (lân) khó tan của các chủng vi sinh vật có trong phân bón vi sinh vật. Phạm vi áp dụng cụ thể bao gồm:
- Các loại phân bón vi sinh vật phân giải phốt phát đã được thương mại hóa hoặc đang trong quá trình nghiên cứu, khảo nghiệm.
- Các chủng vi sinh vật thuần khiết có khả năng phân giải phốt phát khó tan dùng làm nguồn nguyên liệu, chế phẩm để sản xuất phân bón.
- Hoạt động kiểm tra chất lượng, thanh tra, giám sát các sản phẩm phân bón vi sinh vật của các cơ quan quản lý nhà nước và các phòng thử nghiệm được chỉ định.
2. Tài liệu viện dẫn (Điều 2)
Để áp dụng tiêu chuẩn này một cách chính xác, cần viện dẫn các tài liệu kỹ thuật liên quan sau đây. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng bản được nêu, đối với tài liệu không ghi năm công bố thì áp dụng bản mới nhất:
- TCVN 4884 (ISO 4833), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng vi sinh vật trên đĩa thạch - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 30 độ C.
- TCVN 8564:2010, Phân bón vi sinh vật - Phương pháp xác định mật độ vi sinh vật phân giải phốt phát.
- Các tiêu chuẩn quốc gia và quốc tế hiện hành khác liên quan đến việc lấy mẫu, chuẩn bị mẫu thử và an toàn sinh học trong phòng thí nghiệm vi sinh vật.
3. Thuật ngữ và định nghĩa (Điều 3)
Tiêu chuẩn làm rõ các khái niệm chuyên ngành nhằm thống nhất cách hiểu và đồng bộ hóa quy trình thực hành:
- Vi sinh vật phân giải phốt phát (Phosphate solubilizing microorganisms - PSM): Là những vi sinh vật (bao gồm vi khuẩn, nấm men, nấm mốc) có khả năng chuyển hóa các hợp chất phốt phát vô cơ hoặc hữu cơ khó tan (không tan) thành dạng phốt phát hòa tan (dễ tan) mà cây trồng có thể dễ dàng hấp thụ được.
- Hoạt tính phân giải phốt phát: Khả năng và mức độ phân giải hợp chất phốt phát khó tan của vi sinh vật, được biểu thị bằng đường kính vòng phân giải trên môi trường thạch đĩa (định tính/bán định lượng) hoặc bằng hàm lượng phốt pho hòa tan giải phóng vào môi trường dịch thể (định lượng).
4. Nguyên lý của phương pháp (Điều 4)
Phương pháp xác định hoạt tính phân giải phốt phát của vi sinh vật dựa trên hai nguyên lý kỹ thuật cơ bản tùy thuộc vào mục đích thử nghiệm:
- Phương pháp định tính (hoặc bán định lượng) trên môi trường thạch đĩa: Vi sinh vật được cấy trên môi trường dinh dưỡng đặc (thường là môi trường Pikovskaya) có chứa nguồn phốt phát khó tan (như tricalcium phosphate - Ca3(PO4)2) tạo độ đục đồng nhất cho đĩa thạch. Trong quá trình sinh trưởng, vi sinh vật tiết ra các axit hữu cơ hoặc enzyme phosphatase làm hòa tan phốt phát khó tan xung quanh khuẩn lạc, tạo ra một vòng trong suốt (vòng phân giải). Hoạt tính phân giải được đánh giá sơ bộ thông qua việc đo đường kính của vòng trong suốt này (D) so với đường kính khuẩn lạc (d), hoặc tỷ lệ D/d.
- Phương pháp định lượng trong môi trường dịch thể: Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng chứa phốt phát khó tan trong một khoảng thời gian xác định dưới điều kiện lắc đều ở nhiệt độ thích hợp. Sau khi ly tâm loại bỏ tế bào và phần không tan, lượng phốt pho hòa tan giải phóng trong dịch lọc được xác định bằng phương pháp trắc quang (so màu) dựa trên phản ứng tạo phức màu xanh phốt pho-molybdat. Hàm lượng phốt pho hòa tan (tính bằng miligam trên lít hoặc miligam trên gam chế phẩm) tỷ lệ thuận với hoạt tính phân giải của chủng vi sinh vật thử nghiệm.
TIÊU CHUẨN VIỆT NAM
TCVN 8565:2010
PHÂN BÓN VI SINH VẬT - PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PHÂN GIẢI PHỐT PHÁT CỦA VI SINH VẬT
Biofertilizer - Determination of phosphate solubilizing activity of microorganisms
Lời nói đầu
TCVN 8565:2010 được chuyển đổi từ 10 TCN 298-97 theo quy định tại khoản 1 Điều 69 của Luật Tiêu chuẩn và Quy chuẩn kỹ thuật và điểm a khoản 1 Điều 7 Nghị định số 127/2007/NĐ-CP ngày 1/8/2007 của Chính phủ quy định chi tiết thi hành một số điều của Luật Tiêu chuẩn và Quy chuẩn kỹ thuật.
TCVN 8565:2010 do Viện Thổ nhưỡng Nông hóa biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn đo lường chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
PHÂN BÓN VI SINH VẬT - PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PHÂN GIẢI PHỐT PHÁT CỦA VI SINH VẬT
Biofertilizer - Determination of phosphate solubilizing activity of microorganisms
1. Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng khả năng phân giải phốt phát của vi sinh vật trong phân bón vi sinh vật bằng phương pháp định lượng phốt pho hữu hiệu.
2. Tài liệu viện dẫn
Các tài liệu viện dẫn sau đây là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 6167:1996, Phân bón vi sinh vật phân giải hợp chất photpho khó tan
TCVN 8559, Phân bón - Phương pháp xác định phốt pho hữu hiệu.
3. Lấy mẫu
Lấy mẫu phân bón vi sinh vật theo Điều 5 TCVN 6167.
4. Thiết bị, dụng cụ
4.1. Thiết bị
4.1.1. Tủ cấy vô trùng (Box cấy), vận tốc dòng khí trung bình 0,79 m/s, lưu lượng khí 1204m3/h, màng lọc ULPA với kích thước hạt từ 0,1 µm đến 0,3 µm.
4.1.2. Nồi hấp áp lực, áp suất tối thiểu 101,3 kPa, nhiệt độ 121 oC.
4.1.3. Tủ sấy, nhiệt độ từ 40 oC đến 260 oC.
4.1.4. Tủ ấm, nhiệt độ từ 20 oC đến 60 oC.
4.1.5. Máy ly tâm, đạt 6000 vòng/min.
4.1.6. Máy lắc ổn nhiệt, tốc độ lắc đạt 150 vòng/min, nhiệt độ từ 20 oC đến 40 oC.
4.1.7. Cân phân tích, chính xác đến 0,1 mg.
4.1.8. Cân kỹ thuật, chính xác đến 0,01g.
4.2. Dụng cụ
4.2.1. Bình tam giác, dung tích 250 ml.
4.2.2. Ống đong, dung tích 100, 500 ml.
4.2.3. Cốc thủy tinh chịu nhiệt.
4.2.4. Bình định mức, dung tích 50, 100, 1000 ml.
4.2.5. Micropipet, dung tích 100, 1000 µl.
5. Môi trường nuôi cấy
Môi trường Pikovskaya (xem Phụ lục A)
6. Cách tiến hành
6.1. Chuẩn bị
6.1.1. Dụng cụ
- Dụng cụ sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật phải rửa sạch, tiệt trùng bằng một trong các phương pháp dưới đây:
+ giữ ở nhiệt độ 180 oC không ít hơn 1 h trong tủ sấy (4.1.3) hoặc;
+ giữ ở nhiệt độ 121 oC không ít hơn 30 min trong nồi hấp áp lực (4.1.2).
- Dụng cụ sử dụng trong định lượng phốt pho hữu hiệu phải rửa sạch, tráng lại bằng nước cất.
6.1.2. Môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy là môi trường Pikovskaya (phụ lục A), phân phối môi trường vào bình tam giác (4.2.1) với một lượng thích hợp, sao cho sau khi khử trùng, mỗi bình tam giác chứa 90 ml. Làm nút bông và khử trùng ở 121 oC khônjg ít hơn 20 min trong nồi hấp áp lực (4.1.2).
6.1.3. Chuẩn bị thuốc thử
Chuẩn bị thuốc thử theo TCVN 8559.
6.2. Xử lý mẫu
6.2.1. Mẫu thử
- Cân 10 g mẫu chính xác đến 0,01 g, cho vào bình tam giác chứa 90 ml môi trường Pikovskaya đã chuẩn bị sẵn (6.1.2). Mỗi mẫu được lặp lại từ 3 đến 5 lần. Tiến hành cân mẫu trong tủ cấy vô trùng (4.1.1).
- Nuôi cấy trong điều kiện lắc, ở nhiệt độ phù hợp với chủng vi sinh vật, thời gian từ 7 ngày đến 10 ngày;
- Ly tâm dịch nuôi cấy bằng máy ly tâm (4.1.5) với tốc độ 6000 vòng/min trong thời gian 20 min, gạn lấy phần nước trong;
- Xác định lượng phốt pho hữu hiện trong dung dịch theo TCVN 8559.
6.2.2. Mẫu đối chứng (mẫu phân bón không chứa vi sinh vật sống)
- Cân khoảng 10 g mẫu chính xác đến 0,01g, cho vào bình tam giác chứa 90ml môi trường Pikovskaya đã chuẩn bị sẵn (6.1.2). Mỗi mẫu được lặp lại từ 3 đến 5 lần. Tiến hành cân mẫu trong tủ cấy vô trùng (4.1.1).
- Diệt vi sinh vật trong mẫu bằng cách đun cách thủy ở 100 oC ngay sau khi cho mẫu vào.
- Nuôi cấy trong điều kiện lắc, ở nhiệt độ phù hợp với chủng vi sinh vật, thời gian từ 7 ngày đến 10 ngày;
- Ly tâm dịch nuôi cấy bằng máy ly tâm (4.1.5) với tốc độ 6000 vòng/min trong thời gian 20 min, gạn lấy phần nước trong;
- Xác định lượng phốt pho hữu hiệu trong dung dịch theo TCVN 8559.
7. Tính toán kết quả
Hiệu số giữa lượng phốt pho hữu hiệu trong mẫu thử nghiệm và mẫu đối chứng là lượng phốt pho hữu hiệu mà vi sinh vật đã phân giải được. Số lượng này có thể biểu thị bằng tỷ lệ phần trăm hoặc bằng mg P2O5 hữu hiệu.
8. Báo cáo thử nghiệm
Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin sau:
- mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
- tất cả các thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng đến kết quả;
- các kết quả thử nghiệm thu được;
- nếu độ lặp lại được kiểm tra, thì nêu kết quả cuối cùng thu được
PHỤ LỤC A
(Quy định)
MÔI TRƯỜNG PIKOVSKAYA
| Glucoza | 10,0 g |
| Ca3(PO4)2 | 5,0 g |
| (NH4)2SO4 | 0,5 g |
| KCl | 0,2 g |
| MgSO4.7H2O | 0,1 g |
| MnSO4 | vết |
| FeSO4 | vết |
| Cao nấm men | 0,5 g |
| Thạch | 20,0 g |
| Nước cất vừa đủ | 1000 ml |
| pH | 6,8 đến 7,0 |
Để đánh giá hoạt tính phân giải phốt phát của phân bón vi sinh vật chứa chủng vi sinh vật phân giải hợp chất phốt phát hữu cơ khó tan, trong thành phần môi trường nuôi cấy cần thay thế 5 g Ca3(PO4)2 bằng 2 g lexitin.
- 1 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6169:1996 về phân bón vi sinh vật - thuật ngữ
- 2 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6168:1996 về phân bón vi sinh vật giải xenluloza
- 3 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8564:2010 về phân bón vi sinh vật - Phương pháp xác định hoạt tính cố định nitơ của vi khuẩn nốt sần cây họ đậu
- 4 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8566:2010 về phân bón vi sinh vật - Phương pháp đánh giá hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn
- 5 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6166:1996 về phân bón vi sinh vật cố định nitơ
- 6 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 1078:1999 về phân lân canxi magie (phân lân nung chảy) do Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trường ban hành
- 7 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6166:2002 về Phân bón vi sinh vật cố định nitơ
- 8 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12560-1:2018 về Phân bón vi sinh vật - Xác định mật độ nấm rễ nội cộng sinh - Phần 1: Đếm số lượng bào tử nấm nội cộng sinh bằng kỹ thuật sàng ướt, ly tâm nổi
- 9 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12560-2:2018 về Phân bón vi sinh vật - Xác định mật độ nấm rễ nội cộng sinh - Phần 2: Xác định khả năng cộng sinh của các chủng nấm rễ nội cộng sinh với cây trồng
- 1 Luật Tiêu chuẩn và quy chuẩn kỹ thuật 2006
- 2 Nghị định 127/2007/NĐ-CP Hướng dẫn Luật Tiêu chuẩn và Quy chuẩn kỹ thuật
- 3 Quyết định 2945/QĐ-BKHCN năm 2010 công bố Tiêu chuẩn quốc gia do Bộ trưởng Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành
- 4 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6169:1996 về phân bón vi sinh vật - thuật ngữ
- 5 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6168:1996 về phân bón vi sinh vật giải xenluloza
- 6 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6167:1996 về phân bón vi sinh vật phân giải hợp chất photpho khó tan
- 7 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8559:2010 về phân bón - Phương pháp xác định phốt pho hữu hiệu
- 8 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8564:2010 về phân bón vi sinh vật - Phương pháp xác định hoạt tính cố định nitơ của vi khuẩn nốt sần cây họ đậu
- 9 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8566:2010 về phân bón vi sinh vật - Phương pháp đánh giá hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn
- 10 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6166:1996 về phân bón vi sinh vật cố định nitơ
- 11 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 1078:1999 về phân lân canxi magie (phân lân nung chảy) do Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trường ban hành
- 12 Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 298:1997 về phân vi sinh vật - Phân giải hợp chất phot pho khó tan
- 13 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6166:2002 về Phân bón vi sinh vật cố định nitơ
- 14 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12560-1:2018 về Phân bón vi sinh vật - Xác định mật độ nấm rễ nội cộng sinh - Phần 1: Đếm số lượng bào tử nấm nội cộng sinh bằng kỹ thuật sàng ướt, ly tâm nổi
- 15 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12560-2:2018 về Phân bón vi sinh vật - Xác định mật độ nấm rễ nội cộng sinh - Phần 2: Xác định khả năng cộng sinh của các chủng nấm rễ nội cộng sinh với cây trồng