TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 11037 : 2015

SẢN PHẨM CACAO - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG THEOBROM VÀ CAFEIN - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

Cacao products - Determination of theobromine and caffeine content - Liquid chromatographic method

Lời nói đầu

TCVN 11037:2015 được xây dựng trên cơ sở tham khảo AOAC 980.14 Theobromine and caffeine in cacao products.

TCVN 11037:2015 do tiểu ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F16/SC2 Cacao và sản phẩm cacao biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

SẢN PHẨM CACAO - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG THEOBROM VÀ CAFEIN - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

Cacao products - Determination of theobromine and caffeine content - Liquid chromatographic method

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc ký lỏng để xác định hàm lượng theobrom và cafein trong các sản phẩm cacao. Phương pháp này chỉ áp dụng đối với mẫu chứa hàm lượng chất khô không béo không lớn hơn 0,5 g/100 ml nước.

CHÚ THÍCH: Theobrom gần như không tan trong nước (độ tan khoảng 0,5 g/lít ở nhiệt độ phòng).

2. Nguyên tắc

Hòa tan theobrom và cafein trong phần cặn còn lại vào nước nóng sau đó lọc và phân tích các alkaloid (theobrom và cafein) trong dịch lọc bằng phương pháp sắc ký lỏng.

3. Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích.

3.1. Dung dịch chuẩn alkaloid, chứa theobrom và cafein.

Tinh sạch các alkaloid bằng cách cho thăng hoa ở áp suất khí quyển và bảo quản trên silica gel. Cân chính xác một lượng alkaloid thích hợp và pha loãng bằng nước đến nồng độ 50 mg/ml. Lọc qua bộ lọc màng cỡ lỗ 0,45 mg/ml và bảo quản trong lọ polyetylen. Chuẩn bị dung dịch mới sau 3 tuần.

3.2. Pha động, hỗn hợp của metanol (dùng cho sắc ký), axit axetic (CH₃COOH) và nước (20:1:79) (tính theo thể tích).

3.3. Hạt trợ sôi, silic cacbua (SiC) hoặc vật liệu khác không hấp thụ.

3.4. Nước dùng cho sắc ký lỏng, đã cất và khử ion để loại bỏ các vết hữu cơ.

3.5. Ete dầu mỏ.

4. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1. Máy sắc ký, gồm có các bộ phận sau:

- Hệ thống phân phối dung môi, ví dụ model M6000A1).

- Detector hấp thụ, dùng cho mọi máy quang phổ, cài đặt ở bước sóng 280 nm.

- Hệ thống bơm mẫu.

- Bộ ghi, 10 mV có tốc độ ghi trên giấy 0,5 cm/min hoặc bộ tích phân.

- Cột C₁₈, cỡ hạt 10 mm, đường kính trong 4 mm, dài 30 cm.

4.2. Ống nghiệm có nút vặn teflon.

4.3. Nồi cách thủy.

4.4. Bình nón, dung tích 250 ml.

4.5. Bộ lọc màng, cỡ lỗ 45 mm.

4.6. Tủ hốt.

4.7. Máy li tâm, có thể vận hành ở 2 000 r/min.

4.8. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.

5. Lấy mẫu

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Xem tiêu chuẩn cụ thể có liên quan đến sản phẩm. Nếu chưa có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm thì các bên có liên quan nên thỏa thuận với nhau về vấn đề này.

6. Cách tiến hành

6.1. Chiết chất béo

Cân (4.8) khoảng 0,6 g cacao, 4,5 g sôcôla sữa hoặc 1,0 g sôcôla dạng lỏng, chính xác đến 0,1 mg, vào ống nghiệm có nút vặn Teflon (4.2) đã được cân. Chiết chất béo hai lần, mỗi lần dùng 30 ml ete dầu mỏ (3.5), lắc kỹ và ly tâm ở 2 000 r/min trong 10 min và cẩn thận gạn dung môi. Đặt ống vào nồi cách thủy (4.3) để trong tủ hốt (4.6) để loại bỏ ete. Cân ống và cặn đã khô rồi tính khối lượng cặn. Dùng nước để chuyển định lượng lượng chứa trong ống sang bình nón 250 ml (4.4) đã cân trước có chứa vài hạt trợ sôi (3.3).

6.2. Xác định

Thêm nước vào bình nón (6.1) đến khoảng 95 ml. Gia nhiệt đến 100 °C và duy trì trong 25 min. Làm mát đến 20 °C rồi thêm nước sao cho khối lượng cuối cùng bằng tổng khối lượng của bình, các hạt trợ sôi, cặn đã khử chất béo cộng với 100,0 g. Đậy nút bình và lắc kỹ. Chuyển hỗn hợp vào ống ly tâm sau đó ly tâm 5 min ở 2 000 r/min và lọc phần nổi phía trên qua bộ lọc màng cỡ lỗ 45 mm (4.5). Bơm dịch lọc vào máy sắc ký (4.1).

Bơm các dung dịch chuẩn đã lọc vào máy sắc ký (4.1) với tốc độ dòng 1 ml/min ở áp suất danh định 2 000 psi 2), mỗi dãy dung dịch mẫu thử bơm đồng thời ít nhất một dung dịch chuẩn. Nếu cần phân tích nhiều hơn 5 mẫu thì bơm lại dung dịch chuẩn ở các khoảng thời gian đều đặn. Sử dụng chiều cao pic hoặc bộ tích phân để tính nồng độ của từng alkaloid trong dung dịch mẫu thử theo tỷ lệ đơn vị.

7. Tính kết quả

Hàm lượng của từng alkaloid trong mẫu, X, tính bằng miligam trên kilogam (mg/kg) tính bằng công thức:

Trong đó:

A₂ là cường độ tín hiệu (chiều cao pic hoặc diện tích pic) của dung dịch mẫu thử;

A₁ là cường độ tín hiệu của dung dịch chuẩn;

C₁ là nồng độ của của alkaloid trong dung dịch chuẩn, tính bằng microgam trên mililit (mg/ml);

m là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g);

100 là thể tích dung dịch mẫu phân tích cuối cùng, tính bằng mililit (ml).

8. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;