Văn bản pháp luật

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12430:2018 (hoàn toàn tương đương với ISO 17180:2013) về Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng lysin, methionin và threonin trong premix và các chế phẩm axit amin thương mại được Bộ Khoa học và Công nghệ công bố năm 2018, đưa ra phương pháp thử nghiệm chuẩn hóa nhằm xác định chính xác hàm lượng các axit amin thiết yếu này trong các sản phẩm bổ sung thức ăn chăn nuôi.

Phạm vi áp dụng và đối tượng điều chỉnh

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng các axit amin tự do (không liên kết) bao gồm lysin, methionin và threonin trong các chế phẩm axit amin thương mại và premix (thức ăn bổ sung dạng tiền trộn) có hàm lượng hoạt chất lớn hơn 10%. Tiêu chuẩn này không áp dụng trực tiếp cho việc xác định các axit amin này trong thức ăn chăn nuôi hỗn hợp hoặc nguyên liệu thức ăn chăn nuôi thông thường, trừ khi chúng tồn tại dưới dạng chế phẩm thương mại tinh khiết hoặc premix đậm đặc.

Nguyên tắc của phương pháp xác định

Hòa tan mẫu thử trong dung dịch axit clohydric loãng hoặc dung dịch đệm thích hợp để giải phóng hoàn toàn các axit amin tự do.
Tiến hành lọc hoặc ly tâm dịch chiết để thu được dung dịch trong suốt, loại bỏ các tạp chất không tan.
Phân tích hàm lượng lysin, methionin và threonin bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion (IEC) kết hợp dẫn xuất sau cột với ninhydrin, hoặc sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với dẫn xuất trước cột hoặc sau cột thích hợp.
Định lượng các axit amin dựa trên việc so sánh diện tích pic hoặc chiều cao pic của mẫu thử với dung dịch chuẩn đối chiếu có nồng độ đã biết.

Yêu cầu về thiết bị, dụng cụ và hóa chất sử dụng

Hóa chất và thuốc thử: Sử dụng các hóa chất tinh khiết phân tích bao gồm axit clohydric (HCl), nước cất hai lần hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, các chất chuẩn lysin, methionin, threonin có độ tinh khiết tối thiểu 98%, và các dung dịch đệm pha động phù hợp cho hệ thống sắc ký.
Thiết bị sắc ký: Hệ thống sắc ký trao đổi ion (IEC) hoặc sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được trang bị đầu dò UV-Vis hoặc đầu dò huỳnh quang, cột tách chuyên dụng cho axit amin và hệ thống bơm mẫu tự động hoặc thủ công có độ lặp lại cao.
Thiết bị phụ trợ: Cân phân tích có độ chính xác đến 0,1 mg, máy lắc siêu âm, máy ly tâm, bộ lọc màng có kích thước lỗ lọc 0,22 µm hoặc 0,45 µm, và các dụng cụ thủy tinh định mức đạt tiêu chuẩn phòng thí nghiệm.

Quy trình tiến hành thử nghiệm chi tiết

Chuẩn bị mẫu thử: Mẫu thử dạng rắn hoặc lỏng được cân chính xác một lượng phù hợp (tùy thuộc vào hàm lượng dự kiến của axit amin trong mẫu) vào bình định mức. Thêm dung dịch axit clohydric loãng (ví dụ: 0,1 mol/l) hoặc dung dịch đệm, tiến hành lắc đều hoặc xử lý bằng bể siêu âm trong một khoảng thời gian xác định để hòa tan hoàn toàn hoạt chất.
Pha loãng và lọc mẫu: Dung dịch sau khi hòa tan được định mức đến vạch bằng dung dịch chiết, sau đó lọc qua giấy lọc khô hoặc ly tâm. Tiếp tục pha loãng dịch lọc bằng dung dịch đệm pha động để đưa nồng độ axit amin về khoảng tuyến tính của đường chuẩn. Trước khi bơm vào hệ thống sắc ký, dịch lọc phải được lọc qua màng lọc kim có kích thước lỗ 0,22 µm hoặc 0,45 µm.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Pha chế các dung dịch chuẩn đơn thành phần hoặc đa thành phần của lysin, methionin và threonin từ các chất chuẩn tinh khiết. Xây dựng đường chuẩn đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ axit amin và phản ứng của đầu dò (diện tích pic hoặc chiều cao pic).
Tiến hành đo sắc ký: Bơm dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu thử vào hệ thống sắc ký dưới các điều kiện vận hành đã được tối ưu hóa (tốc độ dòng, nhiệt độ cột, bước sóng phát hiện). Đảm bảo sự phân tách hoàn toàn giữa các pic của lysin, methionin, threonin và các tạp chất khác có trong mẫu.

Tính toán và biểu thị kết quả

Hàm lượng của từng axit amin (lysin, methionin, threonin) trong mẫu thử được tính bằng phần trăm khối lượng (%) hoặc gam trên kilôgam (g/kg).
Công thức tính toán dựa trên tỷ lệ diện tích pic của mẫu thử so với diện tích pic của dung dịch chuẩn, kết hợp với các hệ số pha loãng và khối lượng mẫu cân ban đầu.
Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của ít nhất hai phép xác định song song được tiến hành trên cùng một mẫu thử, thỏa mãn các yêu cầu về độ lặp lại quy định trong tiêu chuẩn.

Độ chụm và giới hạn sai số cho phép

Độ lặp lại (r): Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm độc lập, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên cùng một vật liệu thử, trong cùng một phòng thử nghiệm, do cùng một người vận hành, sử dụng cùng một thiết bị trong một khoảng thời gian ngắn, không được vượt quá giới hạn lặp lại quy định (thường từ 2% đến 5% tùy thuộc vào hàm lượng hoạt chất).
Độ tái lập (R): Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên cùng một vật liệu thử, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do các điện thoại viên khác nhau thực hiện trên các thiết bị khác nhau, không được vượt quá giới hạn tái lập quy định.

Hiệu lực thi hành

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12430:2018 (ISO 17180:2013) có hiệu lực kể từ ngày được công bố bởi Bộ Khoa học và Công nghệ. Tiêu chuẩn này là căn cứ kỹ thuật quan trọng phục vụ công tác kiểm tra chất lượng, chứng nhận hợp quy và thanh tra nhà nước đối với các sản phẩm premix và chế phẩm axit amin thương mại lưu thông trên thị trường Việt Nam.

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12430:2018

ISO 17180:2013

THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LYSIN, METHIONIN VÀ THREONIN TRONG PREMIX VÀ CÁC CHẾ PHẨM AXIT THƯƠNG MẠI

Animal feeding stuffs - Determination of lysine, methionine and threonine in commercial amino acid products and premixtures

Lời nói đầu

TCVN 12430:2018 hoàn toàn tương đương với ISO 17180:2013;

TCVN 12430:2018 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F17 Thức ăn chăn nuôi biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LYSIN, METHIONIN VÀ THREONIN TRONG PREMIX VÀ CÁC CHẾ PHẨM AXIT THƯƠNG MẠI

Animal feeding stuffs - Determination of lysine, methionine and threonine in commercial amino acid products and premixtures

CẢNH BÁO - Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đưa ra được tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định định lượng hàm lượng lysin tự do (không nằm trong liên kết protein), methionin và threonin trong premix và các chế phẩm có chứa nhiều hơn khoảng 10 % khối lượng axit amin tương ứng. Tiêu chuẩn này không phân biệt các dạng D-và L-.

CHÚ THÍCH: Trong tiêu chuẩn này, thuật ngữ “axit amin” được sử dụng từ Điều 2 trở đi là lysin, methionin và threonin.

2 Nguyên tắc

Xử lý các mẫu bằng axit clohydric loãng, sau đó pha loãng bằng dung dịch đệm natri xitrat. Bổ sung chất nội chuẩn norleucin và tách axit amin bằng máy phân tích axit amin hoặc sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng cột nhựa trao đổi cation cùng các dung dịch rửa giải đệm natri xitrat. Các axit amin được đo bằng phương pháp đo màu sau phản ứng sau cột với thuốc thử ninhydrin hoặc bằng phương pháp phát hiện huỳnh quang sau phản ứng sau cột với ortho-phthaldialdehyd (OPA).

3 Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác.

3.1 Nước, nước cất hai lần hoặc nước có độ tinh khiết tương đương (độ dẫn điện < 10 µS/cm).

3.2 Các chất chuẩn

3.2.1 Lysin.HCl dạng tinh thể, độ tinh khiết cao đến 99 % khối lượng được làm khô ở điều kiện chân không trong bình hút ẩm chứa P₂O₅ trong 2 ngày trước khi sử dụng.

3.2.2 Threonin dạng tinh thể, độ tinh khiết cao đến 99 % khối lượng được làm khô trong bình hút ẩm chứa P₂O₅ trong 2 ngày trước khi sử dụng.

3.2.3 Methionin dạng tinh thể, độ tinh khiết cao đến 99 % phần khối lượng được làm khô trong bình hút ẩm chứa P₂O₅ trong 2 ngày trước khi sử dụng.

3.3 Norleucin dạng tinh thể, sử dụng làm chất nội chuẩn, độ tinh khiết cao đến 99 % làm khô ở điều kiện chân không trong bình hút ẩm chứa P₂O₅ trong 2 ngày trước khi sử dụng.

3.4 Dung dịch natri hydroxit, c (NaOH) = 7,5 mol/l, dùng để chỉnh pH của dung dịch đệm natri xitrat. Hòa tan cẩn thận 300 g natri hydroxit trong nước (3.1) và thêm nước đến 1 L.

3.5 Axit hydrochloric, γ(HCl) = 370 g/kg.

3.6 Natri xitrat ngậm hai phân tử nước.

3.7 2,2'-Thiodietanol (thiodiglycol).

3.8 Phenol dạng tinh thể, độ tinh khiết cao đến 98,5 % khối lượng.

3.9 Dung dịch đệm natri xitrat, pH 2,20.

Hòa tan 19,61 g natri xitrat ngậm hai phân tử nước (3.6), 5 ml thiodiglycol (3.7), 1 g phenol (3.8) và 16,5 ml HCl (3.5) trong 800 ml nước. Chỉnh pH đến 2,2 bằng vài giọt HCl (3.5) hoặc dung dịch NaOH (3.4). Phenol dùng để bảo quản dung dịch đệm.

Dung dịch đệm natri xitrat cũng có thể được chuẩn bị từ axit xitric và natri clorua.

3.10 Dung dịch axit clohydric, c (HCl) = 0,1 mol/l.

Lấy 8,2 ml HCl (3.5), pha loãng với khoảng 900 ml nước (3.1). Trộn kỹ và pha loãng bằng nước đến 1 L.

3.11 Dung dịch chuẩn axit amin

3.11.1 Dung dịch gốc norleucin chất nội chuẩn, c (Nle) = 2,5 mmol/l.

Hòa tan 0,328 g norleucin (3.3) và chuyển định lượng sử dụng HCl 0,1 mol/l (3.10) cho vào bình định mức 1 L.

Bảo quản ở nhiệt độ dưới 5 °C không quá 6 tháng.

3.11.2 Dung dịch chuẩn gốc axit amin, c = 2,5 mmol/l.

Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc cho từng chất.

Các dung dịch chuẩn chỉ được chứa axit amin cần phân tích, nghĩa là lysin, threonin hoặc methionin. Các dung dịch chuẩn hỗn hợp có bán sẵn, ví dụ: có chứa 18 axit amin, không cho các kết quả tối ưu.

Chuyển 0,456 g lysin.HCl (3.2.1), 0,297 g threonin (3.2.2) và 0,373 g methionin (3.2.3) vào bình định mức 1 L và pha loãng bằng HCl 0,1 mol/l đến vạch.

Bảo quản ở nhiệt độ dưới 5 °C không quá 6 tháng.

3.11.3 Dung dịch hiệu chuẩn axit amin

3.11.3.1 Dung dịch pha loãng theo khối lượng

Cân 2,5 ml của từng dung dịch gốc axit amin m_aa (3.11.2) và 2,5 ml dung dịch gốc norleucin m_N_le (3.11.1), cho vào bình định mức 50 ml. Thêm dung dịch natri xitrat (3.9) đến vạch.

Bảo quản dung dịch ở nhiệt độ dưới 5 °C trong không quá 1 tuần.

3.11.3.2 Dung dịch pha loãng theo thể tích

Dùng pipet (4.4) hoặc bộ pha loãng (4.7), pha loãng các thể tích bằng nhau của dung dịch gốc axit amin (3.11.2) và dung dịch norleucin (3.11.1) bằng dung dịch đệm natri xitrat (3.9), ví dụ: pha loãng 50 µl dung dịch norleucine và 50 µl dung dịch gốc axit amin bằng dung dịch natri xitrat (3.9) đến 1 000 µl, sử dụng bộ pha loãng.

3.12 Dung dịch đệm rửa giải dùng cho cột trao đổi cation

Sử dụng các dung dịch đệm có bán sẵn hoặc chuẩn bị theo các yêu cầu của nhà sản xuất. Thông thường, từ ba đến năm dung dịch đệm được sử dụng có chứa natri xitrat hoặc natri cacbonat, một lượng nhỏ các chất phụ gia và chất bảo quản.

3.13 Thuốc thử ninhydrin hoặc OPA

Sử dụng thuốc thử có bán sẵn hoặc chuẩn bị thuốc thử theo các yêu cầu của nhà sản xuất.

4 Thiết bị, dụng cụ

Chỉ sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể sau đây.

4.1 Cốc thủy tinh, dung tích 1 000 ml

4.2 Bình định mức, dung tích 50 ml, 100 ml, 500 ml, 1 000 ml.

4.3 Ống đong chia vạch, dung tích 100 ml, 1 000 ml.

4.4 Pipet chia vạch, dung tích 5 ml và 10 ml.

4.5 Đĩa khuấy từ hoặc máy lắc cơ học.

4.6 Bộ lọc màng, gồm xenlulose axetat hoặc PVDF, cỡ lỗ 0,2 µm.

4.7 Bộ pha loãng, tùy chọn dùng để pha loãng.

Nếu quá trình tạo dẫn xuất được thực hiện với ninhydrin thì sử dụng tỷ lệ pha loãng từ 1 đến 20 theo thể tích. Sử dụng tỷ lệ cao hơn đối với dẫn xuất OPA. Kiểm tra thường xuyên hệ số biến thiên (CV) của dịch pha loãng bằng cân phân tích; giá trị CV phải nhỏ hơn 1 %.

4.8 Máy đo pH.

4.9 Cân phân tích, có khả năng đọc đến 0,1 mg.

4.10 Máy phân tích axit amin hoặc thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) tương đương.

4.10.1 Cột nhựa trao đổi cation, được đặt trong lò cột.

4.10.2 Cột bảo vệ.

4.10.3 Hệ thống bơm tự động hoặc bơm tay, có thể bơm các thể tích từ 10 µl đến 100 µl.

4.10.4 Bơm HPLC, dùng cho dung dịch đệm.

4.10.5 Bơm tạo dẫn xuất sau cột ninhydrin hoặc OPA.

4.10.6 Detector UV, cài đặt ở bước sóng 440 nm và 570 nm đối với phản ứng sau cột của ninhydrin hoặc detector huỳnh quang cài đặt ở bước sóng kích thích 330 nm và bước sóng phát xạ 460 nm đối với phản ứng sau cột của OPA.

4.10.7 Hệ thống thu thập và xử lý dữ liệu, dùng để tích phân các pic.

5 Cách tiến hành

5.1 Chuẩn bị mẫu thử

Nghiền (xay hoặc giã) mẫu cho đến khi mẫu lọt qua sàng cỡ lỗ 0,25 mm. Đồng hóa kỹ mẫu.

5.2 Số lượng dịch chiết cần chuẩn bị

Từ mỗi mẫu thử chuẩn bị hai dịch chiết khác nhau.

5.3 Chiết sử dụng dung dịch pha loãng theo khối lượng

5.3.1 Các chế phẩm axit amin tinh khiết thương mại

Cân từ 0,45 g đến 0,47 g lysine.HCl (3.2.1), từ 0,29 g đến 1,31 g threonin (3.2.2), từ 0,36 g đến 0,38 g methionin (3.2.3) cho vào các chai 500 ml đã cân trước. Thêm khoảng 400 ml HCl 0,1 mol/l (3.10). Hòa tan axit amin bằng máy khuấy từ (4.5) trong 30 min, có khuấy liên tục. Xác định tổng khối lượng của thể tích dịch chiết (m_ex), dùng pipet chia vạch (4.4) lấy 1 ml dịch chiết, cân (m_ali) và cho vào bình định mức 50 ml. Cân thêm 2,5 ml dung dịch norieucin (3.11.1) (m_Nl_e) cho vào bình, sau đó thêm dung dịch đệm xitrat (3.9) đến vạch và trộn đều.

Nếu dung dịch mẫu không được kiểm tra trong cùng ngày thì bảo quản các dung dịch này ở nhiệt độ dưới 5 °C không quá 1 tuần.

5.3.2 Đối với premix hoặc các chế phẩm axit amin không tinh khiết thương mại

Tính khối lượng gần đúng của phần mẫu thử, m_tp _premix, theo axit amin có giá trị dự kiến thấp nhất, tính bằng gam, sử dụng Công thức (1):

Trong đó:

m_{tp pure aa} là khối lượng phần mẫu thử dùng cho axit amin tinh khiết, tính bằng gam (g);

w_exp là phần khối lượng dự kiến của axit amin có hàm lượng thấp nhất, tính bằng gam trên 100 g (g/100g).

Ví dụ: premix có 20 % khối lượng DL-methionin thì cần phần mẫu thử có khối lượng từ 1,8 g đến 1,9 g.

Cân khối lượng phần mẫu thử đã tính được cho vào chai 500 ml đã biết khối lượng. Thêm khoảng 400 ml dung dịch HCl 0,1 mol/l. Hòa tan premix bằng máy khuấy từ trong 30 min, có khuấy liên tục. Xác định tổng khối lượng thể tích dịch chiết (m_ex), dùng pipet (4.4) lấy 1 ml dịch chiết, cân (m_al_i) và cho vào bình định mức 50 ml. Cân thêm 2,5 ml dung dịch gốc norleucin (3.11.1) (m_N_l_e) cho vào bình, sau đó thêm dung dịch đệm xitrat (3.9) đến vạch và trộn đều.

Nếu premix chứa các axit amin có hàm lượng dự kiến cao thì chuẩn bị các dung dịch pha loãng sử dụng lượng dịch chiết nhỏ hơn 1 ml cùng 2,5 ml norleucin (3.11.1) (m_M_l_e)

Nếu các dung dịch mẫu không được kiểm tra trong cùng ngày thì các dung dịch này phải được bảo quản ở nhiệt độ dưới 5 °C không quá 3 ngày.

5.4 Chiết sử dụng dung dịch pha loãng theo thể tích

5.4.1 Các chế phẩm axit amin tinh khiết thương mại

Cân từ 0,45 g đến 0,47 g lysin.HCl, từ 0,29 g đến 0,31 g threonin, từ 0,36 g đến 0,38 g methionin. Chuyển định lượng bằng HCl 0,1 mol/l (3.10) vào bình định mức 1 L, hòa tan trong khoảng 900 ml HCl 0,1 mol/l, bằng máy khuấy từ (4.5) trong 30 min, có khuấy liên tục. Thêm HCl 0,1 mol/l đến vạch và trộn đều.

Pha loãng và thêm dung dịch norleucin (3.11.1) theo quy trình quy định trong 3.11.3.2 để chuẩn bị dung dịch hiệu chuẩn.

Nếu dung dịch mẫu không được kiểm tra trong ngày phân tích thì dung dịch này phải được bảo quản ở nhiệt độ dưới 5 °C không quá 3 ngày.

5.4.2 Đối với premix hoặc các chế phẩm axit amin không tinh khiết thương mại

Tính khối lượng gần đúng của phần mẫu thử (m_{tp premix}) theo axit amin có các giá trị dự kiến thấp nhất (w_exp) như quy định trong 5.3.2, tính bằng gam. Việc chiết lượng mẫu thử cần đảm bảo rằng tất cả các pic axit amin đều nằm trong dải tuyến tính hiệu chuẩn. Cân lượng phần mẫu thử này và chuyển định lượng bằng HCl 0,1 mol/l (3.10) vào bình định mức 1 L. Hòa tan trong khoảng 900 ml HCl 0,1 mol/l bằng máy khuấy từ (4.5) trong 30 min, có khuấy liên tục. Thêm HCl 0,1 mol/l đến vạch và trộn đều. Pha loãng và thêm dung dịch norleucin theo quy trình quy định trong 3.11.3.2 để chuẩn bị dung dịch hiệu chuẩn.

Nếu premix chứa các axit amin có hàm lượng dự kiến cao hơn thì chuẩn bị các dịch pha loãng sử dụng một lượng dịch chiết nhỏ hơn 1 ml cộng với 2,5 ml norleucin.

Nếu các dung dịch mẫu thử không được kiểm tra trong ngày phân tích thì các dung dịch này phải được bảo quản ở nhiệt độ dưới 5 °C không quá 3 ngày.

5.5 Chạy sắc ký

Đưa một lượng thích hợp dung dịch thử qua bộ lọc màng (4.6) vào lọ (vial) lấy mẫu tự động và bơm vào máy phân tích hoặc hệ thống HPLC (4.10). Thể tích bơm thường từ 20 µl đến 50 µl.

Hệ thống sắc ký phải tách riêng được các axit amin và tách ra khỏi các thành phần khác (ví dụ: amoniac, amin, peptid hoặc đường amin).

Trên đường nền các axit amin phân tích phải tách được 100 % ra khỏi tất cả các pic khác đã được rửa - giải để tránh các kết quả sai lệch gây ra do trùng pic. Hệ thống sắc ký cần cho một đáp ứng tuyến tính trong dải nồng độ của đường chuẩn.

6 Tính kết quả

6.1 Nguyên tắc của phương pháp và kiểm soát việc hiệu chuẩn

Hàm lượng trong mẫu được tính bằng cách sử dụng kết quả của dung dịch hiệu chuẩn ban đầu (3.11.3). Để kiểm tra không có độ trôi, bơm các dung dịch hiệu chuẩn để kiểm soát chất lượng sau mỗi lần bơm bốn dung dịch thử. Nếu độ thu hồi của các dung dịch kiểm soát này nằm ngoài khoảng từ 99 % đến 101 % thì lặp lại phép phân tích.

Xác định diện tích pic của các pic axit amin trong các dung dịch hiệu chuẩn và các dịch chiết mẫu thử bằng cách tích phân và tính hàm lượng axit amin của phần mẫu thử theo quy định trong 6.2 hoặc 6.3, theo phần trăm khối lượng.

6.2 Tính kết quả khi sử dụng dung dịch pha loãng theo khối lượng

Tính hệ số đáp ứng (F_R_aa) đối với từng axit amin, sử dụng Công thức (2):

(2)

Trong đó:

A_{Nle c} là diện tích pic của norleucin trong dung dịch hiệu chuẩn;

m_aa là khối lượng của 2,5 ml dung dịch gốc axit amin, tính bằng gam (g);

A_{aa c} là diện tích pic của axit amin trong dung dịch hiệu chuẩn;

m_Nle là khối lượng của 2,5 ml dung dịch gốc norleucin, tính bằng gam (g).

Tính hàm lượng axit amin trong mẫu thử, w_aa, theo phần trăm khối lượng, sử dụng Công thức (3):

(3)

Trong đó:

A_{aa ts} là diện tích pic của axit amin trong dung dịch thử;

A_{Nle ts} là diện tích pic của norleucin trong dung dịch thử;

F_{R aa} là hệ số đáp ứng của các axit amin;

γ_aa là nồng độ của axit amin trong dung dịch gốc, giả định rằng 1 L dung dịch có khối lượng 1 000 g, tính bằng gam trên 1 000 g (g/1 000 g);

m_{Nle ts} là khối lượng của 2,5 ml dung dịch gốc norleucin trong dung dịch thử; tính bằng gam (g);

m_ex là tổng khối lượng của dịch chiết, tính bằng gam (g);

m_a_li là khối lượng dịch chiết được sử dụng, tính bằng gam (g);

m_lp là khối lượng của phần mẫu thử, tính bằng gam (g).

6.3 Tính kết quả khi sử dụng dung dịch pha loãng theo thể tích

Tính hệ số đáp ứng (F_R_aa) đối với từng amino axit, sử dụng Công thức (4):

Trong đó

A_{Nle c} là diện tích pic của norleucin trong dung dịch hiệu chuẩn;

A_{aa c} là diện tích pic của axit amin trong dung dịch hiệu chuẩn.

Tính hàm lượng axit amin trong mẫu thử, w_aa, theo phần trăm khối lượng, sử dụng Công thức (5):

(5)

Trong đó:

A_{aa ts} là diện tích pic của amino axit trong dung dịch thử;

A_{Nle ts} là diện tích pic của norleucin trong dung dịch thử;

F_R_aa là hệ số đáp ứng của các axit amin;

γ_aa là nồng độ axit amin trong dung dịch gốc, tính bằng gam trên lít (g/l);

m_tp là khối lượng của phần mẫu thử, tính bằng gam (g).

CHÚ THÍCH: Các kết quả của việc tính toán được biểu thị trên sản phẩm "thực tế". Để tính độ tinh khiết theo quy định, nghĩa là hàm lượng axit amin trong sản phẩm khô, thì tính theo chất khô của sản phẩm. Độ tinh khiết thu được trực tiếp, nếu sản phẩm được làm khô trước khi phân tích.

Kết quả đối với lysine.HCl có thể được chuyển đổi thành lysine theo công thức sau:

Trong đó:

w_L_ys là phần khối lượng của lysin;

w_L_ys.HCl là phần khối lượng của lysin.HCl.

7 Độ chụm

7.1 Phép thử liên phòng thử nghiệm

Chi tiết các phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục A.

7.2 Độ lặp lại

Thực hiện lặp lại hai lần các phép phân tích.

Tính độ chệch tương đối, biểu thị bằng phần trăm

Trong đó:

w_aa₁ là giá trị thứ nhất;

w_aa2 là giá trị thứ hai;

|w_aa1 - w_aa2| là chênh lệch tuyệt đối giữa hai giá trị.

Báo cáo giá trị trung bình nếu D nhỏ hơn 1,5 %.

Nếu giá trị D lớn hơn thì thực hiện phép phân tích trên dịch chiết thứ ba và báo cáo giá trị trung bình của ba lần xác định.

Nếu hệ số biến thiên (CV) nhỏ hơn hoặc bằng 3 % thì ghi lại giá trị trung bình của ba lần xác định.

Nếu hệ số biến thiên (CV) lớn hơn 3 % thì lặp lại phép phân tích các dung dịch thử sau khi đồng hóa.

Nếu kết quả thu được của hai dịch chiết mới không được xác nhận (D > 1,5 %) thì lỗi này là do máy sắc ký. Kiểm tra máy phân tích và lặp lại tất cả các phép đo bị ảnh hưởng.

7.3 Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm (trung bình của hai lần xác định) thu được, sử dụng cùng một phương pháp, trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do người thực hiện khác nhau, sử dụng thiết bị khác nhau, 95 % trường hợp nhỏ hơn giới hạn tái lập R nêu trong Phụ lục A.

8 Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải có ít nhất các thông tin sau:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã dùng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm;

e) kết quả thử nghiệm thu được;

f) nếu tính kiểm tra độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng.

Phụ lục A

(tham khảo)

Dữ liệu thu được từ nghiên cứu cộng tác

Nghiên cứu cộng tác xác định hàm lượng lysin, methionin và threonin trong các chế phẩm hoặc premix có axit amin đậm đặc thương mại, gồm có 17 phòng thử nghiệm tham gia. Phân tích lặp lại hai lần 13 mẫu, bốn mẫu axit amin tinh khiết và sáu mẫu premix bao gồm 3 cặp trùng khớp Youden.

Xem Bảng A.1.

Bảng A.1 - Các kết quả thu được từ nghiên cứu cộng tác

Chế phẩm hoặc premix	Axit amin^a	Giá trị dự kiến %	Số lượng phòng thử nghiệm	Giá trị trung bình %	Độ lệch chuẩn lặp lại s_r	Hệ số biến thiên lặp lại, *C_v*_,_r %	Độ lệch chuẩn tái lập, S_R	Hệ số biến thiên tái lập, C_V,_R %	Giới hạn lặp lại r= 2,8 s_r	Giới hạn tái lập R = 2,8 S_R	Giá trị horrat
Số 1 Bioly	Lys		17	45,89	0,39	0,84	1,06	2,31	1,08	2,96	1,03
Số 2 premix	Met	27,00	16	26,55	0,41	1,56	0,49	1,85	1,16	1,37	0,76
Số 2 premix	Thr	15,00	16	14,85	0,19	1,29	0,35	2,33	0,54	0,97	0,88
Số 3 premix	Lys	20,80	17	20,56	0,27	1,33	0,51	2,49	0,77	1,44	0,98
	Met	11,00	17	11,26	0,14	1,24	0,21	1,84	0,39	0,58	0,66
	Thr	8,00	17	8,22	0,05	0,65	0,16	1,9	0,15	0,44	0,65
Số 4 premix	Lys	16,80	17	16,63	0,22	1,29	0,39	2,32	0,6	1,08	0,89
	Met	14,00	17	14,21	0,13	0,93	0,27	1,92	0,37	0,76	0,72
	Thr	11,00	17	11,19	0,09	0,82	0,25	2,22	0,26	0,7	0,8
Số 5 premix	Lys	12,80	17	12,58	0,09	0,74	0,23	1,86	0,26	0,65	0,68
	Met	32,00	17	32,04	0,16	0,5	0,83	2,59	0,45	2,32	1,09
	Thr	22,00	17	22,1	0,18	0,81	0,43	1,94	0,5	1,2	0,77
Số 6 premix	Lys	12,29	17	12,3	0,21	1,68	0,26	2,13	0,58	0,73	0,78
	Met	30,72	17	30,59	0,32	1,06	0,76	2,5	0,9	2,14	1,05
	Thr	21,12	17	21,25	0,25	1,18	0,4	1,87	0,7	1,11	0,74
Số 7 premix	Lys	10,40	17	10,27	0,12	1,21	0,19	1,81	0,35	0,52	0,64
	Met	9,00	17	9,1	0,08	0,92	0,13	1,48	0,23	0,38	0,52
	Thr	14,00	17	14,03	0,1	0,7	0,29	2,07	0,27	0,81	0,77
Số 8 premix	Lys	10,24	17	10,12	0,12	1,21	0,15	1,5	0,34	0,42	0,53.
	Met	8,86	17	8,91	0,08	1,17	0,17	1,89	0,29	0,47	0,66
	Thr	13,79	17	13,83	0,19	1,35	0,31	2,25	0,52	0,87	0,84
Số 9 premix	Lys	24,00	17	23,48	0,26	1,13	0,5	2,15	0,74	1,41	0,86
	Met	19,00	17	19,09	0,19	0,99	0,33	1,73	0,53	0,93	0,67
	Thr	15,00	17	15,09	0,15	1	0,3	1,99	0,42	0,84	0,75
Số 10 premix	Lys	23,28	17	22,85	0,19	0,84	0,41	1,78	0,54	1,14	0,71
	Met	18,43	17	18,65	0,13	0,68	0,29	1,53	0,36	0,8	0,59
	Thr	14,55	17	14,56	0,14	0,96	0,31	2,15	0,4	0,88	0,81
Số 11 L- Lysin.HCl	Lys	76,04	17	74,11	0,69	0,93	1,32	1,78	1,93	3,7	0,85
Số 12 DL- methionin	Met	93,55	17	93,27	0,79	0,85	1,42	1,52	2,22	3,98	0,75
Số 13 L-threonin	Thr	95,95	17	95,46	1,11	1,17	2,07	2,16	3,12	5,78	1,07
* Lys = lysin; Met = methionin, Thr = threonin

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] AOAC Official Method 999 13, Lysine, methionine, and threonine in feed grade amino acids and premixes

[2] J. Fontaine, M. Eudaimon, Liquid chromatographic determination of lysine, methionine, and threonine in pure amino acids (feed grade) and premixes: Collaborative study. J. AOAC Int. 2000, 83 pp. 771-783

Văn bản liên quan cùng nội dung

Văn bản liên quan nội dung

HIỆU LỰC VĂN BẢN

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12430:2018 (ISO 17180:2013) về Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng lysin, methionin và threonin trong premix và các chế phẩm axit thương mại

Số hiệu: TCVN12430:2018

Loại văn bản: Tiêu chuẩn Việt Nam

Ngày ban hành: 01/01/2018

Nơi ban hành: ***

Người ký: ***

Ngày công báo: Đang cập nhật

Số công báo: Đang cập nhật

Ngày hiệu lực: Đang cập nhật

Tình trạng: ● Còn hiệu lực

Lĩnh vực: Nông nghiệp

Tải văn bản

Tải bản Word Tải bản PDF

Hỏi Đáp AI (Demo)

Online

👋 Xin chào! Tôi là Trợ lý AI Pháp Luật. Bạn cần giải đáp hoặc tóm tắt điều khoản nào trong Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12430:2018 (ISO 1718...?

✨ 3 điểm chính 📅 Ngày hiệu lực ✍️ Người ký

Chế độ Trả lời thông minh A.I

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 12430:2018 (ISO 17180:2013) về Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng lysin, methionin và threonin trong premix và các chế phẩm axit thương mại