TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 9515:2012

THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH 5'-MONONUCLEOTID BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Foodstuffs - Determination of 5'-mononucleotides by high performance liquid chromatography (HPLC)

Lời nói đầu

TCVN 9515:2012 được xây dựng dựa trên cơ sở AOAC 2011.20 Routine analysis of 5'-mononucleotides in infant formula and adult/pediatric nutritional formula by liquid chromatography;

TCVN 9515:2012 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH 5'-MONONUCLEOTID BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Foodstuffs - Determination of 5'-mononucleotides by high performance liquid chromatography (HPLC)

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng 5'-mononucleotid trong thực phẩm bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Phương pháp này đã được đánh giá xác nhận trên các mẫu thức ăn công thức dùng cho trẻ sơ sinh và sản phẩm bổ sung 5'-mononucleotid dành cho người lớn.

2. Nguyên tắc

Mẫu thử được hòa tan trong dung dịch có nồng độ muối cao để ức chế các tương tác với protein và chất béo. Các hợp chất 5'-mononucleotid gồm uridin 5'-monophosphat (UMP), inosin 5'-monophosphat (IMP), adenosin 5'-monophosphat (AMP), guanosin 5'-monophosphat (GMP) và cytidin 5'-phosphat (CMP) được phân tách từ nền mẫu bằng chiết pha rắn trao đổi anion mạnh (SPE) sau đó phân tích bằng sắc kí dùng cột pha tĩnh C₁₈, gradient rửa giải, dùng detector UV và định lượng bằng kĩ thuật nội chuẩn dùng thymidin 5'-monophosphat (TMP).

3. Thuốc thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và chỉ sử dụng nước có điện trở suất không nhỏ hơn 18 MW cm, trừ khi có quy định khác.

3.1. Metanol

3.2. Dung dịch đệm, kali dihydro phosphat (KH₂PO₄), 0,25M, pH 3,5

Hòa tan 34,02g kali dihydro phosphat trong 900 ml nước và chỉnh pH đến 3,5 bằng axit orthophosphoric. Pha loãng đến 1 lít.

3.3. Dung dịch chiết, natri clorua (NaCl) 1 M và axit etylendiamintetraaxetic (EDTA) 5mM

Hòa tan 58,5 g natri clorua và 1,46 g EDTA trong nước. Pha loãng đến 1 lít.

3.4. Dung dịch kali bromua (KBr), 0,3 M

Hòa tan 3,57g kali bromua trong 100ml nước.

3.5. Dung dịch rửa giải, kali dihydro phosphat (KH₂PO₄), 0,5 M, pH 3,0

Hòa tan 6,805 g kali dihydro phosphat trong 90 ml nước và chỉnh pH đến 3,0 bằng axit orthophosphoric. Pha loãng đến 100 ml.

3.6. Dung môi pha động A, kali dihydro phosphat (KH₂PO₄), 10mM, pH 5,6

Hòa tan 1,36 g kali dihydro phosphat trong 900ml nước và chỉnh pH đến 5,6 bằng dung dịch kali hydroxit (KOH) 10% (khối lượng/thể tích). Pha loãng bằng nước đến 1 lít.

Chuẩn bị dung dịch trong ngày sử dụng.

CHÚ THÍCH: Việc chuẩn bị dung dịch trong ngày sử dụng để tránh sự phát triển của vi sinh vật trong đệm phosphat ở nhiệt độ phòng khi dung dịch đệm chứa hàm lượng thấp hoặc không chứa dung môi vô cơ.

3.7. Dung môi pha động B, 100% metanol.

3.8. Chất chuẩn và dung dịch chuẩn

3.8.1. Chất chuẩn

Sử dụng các chất chuẩn có độ tinh khiết ≥ 99% (sản phẩm của Sigma hoặc tương đương):

TMP.-CAS No. 365-07-1

AMP.-CAS No. 61-19-8

CMP.-CAS No. 63-37-6

GMP.-CAS No. 85-32-5

IMP.-CAS No. 131-99-7

UMP.-CAS No. 58-97-9

3.8.2. Dung dịch chuẩn gốc, 1 mg/ml

Cân chính xác khoảng 50 mg mỗi chất chuẩn TMP, AMP, CMP, GMP, IMP và UMP, cho vào các bình định mức 50 ml riêng rẽ. Thêm 40 ml nước, trộn đến khi hòa tan và thêm nước đến vạch.

3.8.3. Dung dịch chuẩn tinh khiết

Dùng pipet lấy 1,0 ml mỗi dung dịch chuẩn gốc (3.8.2) vào các bình định mức 50 ml riêng rẽ, thêm dung dịch đệm (3.2) đến vạch và đo độ hấp thụ tại bước sóng hấp thụ cực đại để xác định nồng độ của mỗi dung dịch chuẩn gốc nucleotid.

Bảng 1 - Bước sóng hấp thụ cực đại và hệ số tắt của các nucleotid

3.8.4. Dung dịch chuẩn nội, 80 mg/ml

Pha loãng 4 ml dung dịch chuẩn gốc TMP (3.8.2) trong 50 ml nước.

3.8.5. Dung dịch chuẩn làm việc, 40 mg/ml

Dùng pipet lấy 2 ml mỗi dung dịch chuẩn gốc AMP, CMP, GMP, IMP và UMP (3.8.2) vào cùng một bình định mức 50ml và thêm nước đến vạch.

3.8.6. Dung dịch hiệu chuẩn, nồng độ danh nghĩa theo quy định trong Bảng 2.

Bảng 2 - Nồng độ danh nghĩa của các dung dịch hiệu chuẩn

3.8.6.1. Dung dịch hiệu chuẩn 1

Dùng pipet lấy 0,25 ml dung dịch chuẩn làm việc (3.8.5) và 1 ml dung dịch chuẩn nội (3.8.4) vào bình định mức 25 ml và thêm nước đến vạch.

3.8.6.2. Dung dịch hiệu chuẩn 2

Dùng pipet lấy 0,5 ml dung dịch chuẩn làm việc (3.8.5) và 1 ml dung dịch chuẩn nội (3.8.4) vào bình định mức 25 ml và thêm nước đến vạch.

3.8.6.3. Dung dịch hiệu chuẩn 3

Dùng pipet lấy 2 ml dung dịch chuẩn làm việc (3.8.5) và 1 ml dung dịch chuẩn nội (3.8.4) vào bình định mức 25 ml và thêm nước đến vạch.

3.8.6.4. Dung dịch hiệu chuẩn 4

Dùng pipet lấy 5 ml dung dịch chuẩn làm việc (3.8.5) và 1 ml dung dịch chuẩn nội (3.8.4) vào bình định mức 25 ml và thêm nước đến vạch.

4. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1. Hệ thống HPLC, được trang bị bơm, bộ bơm mẫu với vòng bơm 50 ml, bộ khử khí, buồng cột và detector mảng diot.

4.2. Cột C18, loại Gemini có cỡ hạt 5 mm, kích thước 250 mm x 4,6 mm 1) hoặc tương đương.

4.3. Máy đo phổ.

4.4. Dụng cụ đo pH.

4.5. Ống li tâm, làm bằng polypropylen, dung tích 50 ml.

4.6. Xyranh sử dụng một lần, dung tích 3 ml.

4.7. Bộ lọc màng, với màng lọc bằng xenlulo axetat, cỡ lỗ 0,2 mm.

4.8. Bộ bơm chân không SPE.

4.9. Cột SPE, chiết pha rắn trao đổi anion mạnh (SPE) polypropylen chromabond SB, 6 ml x 1000 mg 2).

4.10. Màng lọc, bằng nylon cỡ 0,45 mm.

4.11. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,01 mg.

4.12. Máy vortex.

4.13. Lọ đựng mẫu.

5. Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này.

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không được hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình bảo quản và vận chuyển.

6. Cách tiến hành

6.1. Chuẩn bị mẫu thử

Cân chính xác khoảng 1 g mẫu thử dạng bột, chính xác đến 0,01 mg hoặc 10 ml mẫu thử dạng lỏng, cho vào ống li tâm 50 ml (4.5). Hòa tan mẫu thử trong 30 ml dung dịch chiết (3.3), thêm 1,0 ml dung dịch chuẩn nội TMP (3.8.4). Đậy nắp ống li tâm và trộn bằng máy vortex (4.12). Để yên mẫu trong 10 min để quá trình hydrat hóa xảy ra hoàn toàn. Pha loãng đến thể tích cuối cùng 50 ml bằng nước. Đậy nắp ống li tâm và trộn bằng máy vortex.

6.2. Chiết mẫu

LƯU Ý: Trong quá trình chiết, không để cột bị khô mà cho từng giọt chảy vào cột, với tốc độ dòng nhỏ hơn 2 ml/min.

Đối với mỗi mẫu thử, đặt cột SPE (4.9) nối với bơm chân không (4.8). Ổn định cột bằng cách rửa giải với 4 ml metanol (3.1) sau đó rửa giải hai lần bằng nước, mỗi lần dùng 5 ml. Cho 4 ml dung dịch mẫu thử (6.1) lên cột. Rửa cột bằng 4 ml dung dịch kali bromua (3.4) để loại bỏ các chất gây nhiễu.

Rửa giải các nucleotid bằng 4ml dung dịch rửa giải SPE (3.5), cho vào ống nghiệm. Lọc dịch rửa giải qua bộ lọc màng 0,2 mm (4.7), lấy khoảng 2 ml dịch lọc vào lọ đựng mẫu (4.13).

6.3. Tiến hành sắc kí

Tạo gradient bằng cách trộn dung môi pha động A (3.6) và dung môi pha động B (3.7) theo quy trình quy định trong Bảng 3.

Bảng 3 - Quy trình gradient để phân tách bằng sắc kí

Dải phổ yêu cầu nằm trong khoảng từ 210 nm đến 300 nm, dùng detector mảng diot với chương trình sắc kí được cài đặt tại các bước sóng quy định sau đây trước khi định lượng.

- đối với IMP: 250nm;

- đối với AMP, GMP và TMP: 260 nm;

- đối với CMP và UMP: 270 nm;

Cài đặt nhiện độ buồng cột ở 40^oC.

6.4. Dựng đường chuẩn

Dựng đường cong hồi quy tuyến tính theo tỉ lệ của diện tích pic (các nucleotid và TMP) trên trục y so với tỉ lệ của các nồng độ tương ứng trên trục x của các dung dịch hiệu chuẩn và tính độ dốc khi đưa giao điểm với trục y về 0.

7. Tính kết quả

7.1. Tính độ tinh khiết của mỗi nucleotid (dưới dạng axit tự do) của chất chuẩn, P, tính bằng phần trăm (%), theo công thức sau:

P = x  x                   (1)

Trong đó:

A là độ hấp thụ tia UV tại bước sóng cực đại;

 là hệ số tắt của nucleotid;

W₁ là khối lượng của chất chuẩn gốc nucleotid, tính bằng gam (g);

V₁ là thể tích của dung dịch chuẩn gốc, tính bằng mililit (V₁ = 50 ml);

V₂ là thể tích của dung dịch chuẩn xác định độ tinh khiết, tính bằng mililit (V_2­ = 50 ml);

V₃ là thể tích của dung dịch chuẩn gốc bổ sung vào dung dịch chuẩn xác định độ tinh khiết, tính bằng mililit (V₃ = 1 ml).

7.2. Tính nồng độ của nucleotid trong các dung dịch chuẩn gốc, X₁, bằng microgam trên mililit mẫu (mg/ml), theo công thức sau:

X₁ =  x  x 10⁶               (2)

Trong đó:

W₁ là khối lượng của các chất chuẩn gốc nucleotid, tính bằng gam (g);

V₁ là thể tích của dung dịch chuẩn gốc, tính bằng mililit (V­­₁ = 50 ml);

P là độ tinh khiết của nucleotid, tính bằng phần trăm (%);

100 là hệ số chuyển đổi từ phần trăm sang số thập phân;

10⁶ là hệ số chuyển đổi từ gam trên mililit (g/ml) sang microgam trên mililit (mg/ml).

7.3. Tính nồng độ của TMP trong dung dịch chuẩn nội, X₂, tính bằng microgam trên mililit (mg/ml), theo công thức sau:

X₂ = X₁ x                             (3)

Trong đó:

X₁ là nồng độ của nucleotid trong dung dịch chuẩn gốc, tính bằng microgam trên mililit (mg/ml);

V₄ là thể tích dung dịch chuẩn gốc trong dung dịch chuẩn nội, tính bằng mililit (V₄ = 4ml);

V₅ là thể tích dung dịch chuẩn nội, tính bằng mililit (V­₅ = 50 ml).

7.4. Tính nồng độ nucleotid trong dung dịch hiệu chuẩn, X₃, tính bằng microgam trên mililit (mg/ml), theo công thức sau:

X_­3 = X₁ x  x                   (4)

Trong đó:

X₁ là nồng độ của nucleotid trong dung dịch chuẩn gốc, tính bằng microgam trên mililit (mg/ml);

V₆ là thể tích dung dịch chuẩn gốc trong dung dịch chuẩn làm việc, tính bằng mililit (V_­6 = 2 ml);

V_­7 là thể tích dung dịch chuẩn làm việc, tính bằng mililit (V­­­₇ = 50 ml);

V_8­ là thể tích dung dịch chuẩn làm việc trong dung dịch hiệu chuẩn, tính bằng mililit (ml);

V­­­₉ là thể tích dung dịch hiệu chuẩn, tính bằng mililit (V₉ = 25 ml).

7.5. Tính nồng độ của TMP trong dung dịch hiệu chuẩn, X₄, tính bằng microgam trên mililit (mg/ml), theo công thức sau:

X₄ = X₂ x                (5)

Trong đó:

X₂ là nồng độ của TMP trong dung dịch chuẩn nội, tính bằng microgam trên mililit (mg/ml);

V₁₀ là thể tích dung dịch chuẩn làm việc trong dung dịch hiệu chuẩn, tính bằng mililit (V₁₀ = 1 ml);

V₁₁ là thể tích dung dịch hiệu chuẩn, tính bằng mililit (V₁₁ = 25 ml).

7.6. Hàm lượng nucleotid bổ sung được tính dựa trên đường chuẩn.

Đối với mẫu dạng bột, tính hàm lượng nucleotid, X, tính bằng miligam trên hectogam (mg/hg), theo công thức sau:

X =  x  x  x                    (6)

Đối với mẫu dạng lỏng, tính hàm lượng nucleotid, X, tính bằng miligam trên dexilit (mg/dl), theo công thức sau:

X =  x  x  x                   (7)

Trong đó:

A_NT là diện tích pic nucleotid tương ứng với mẫu thử;

A_IS­ là diện tích pic TMP tương ứng với mẫu thử;

L là độ dốc của đường chuẩn hồi quy tuyến tính;

C_IS là nồng độ của chất chuẩn nội bổ sung vào mẫu thử, tính bằng microgam trên mililit (mg/ml);

V_IS là thể tích chất chuẩn nội bổ sung vào mẫu thử, tính bằng mililit (ml);

W là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g);

V là thể tích mẫu thử dạng lỏng, tính bằng mililit (ml);

100 là hệ số chuyển đổi từ gam sang hectogam hoặc từ mililit sang dexilit;

1000 là hệ số chuyển đổi từ microgam sang miligam hoặc từ mililit sang lít.

8. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm các thông tin sau:

a) mọi thông tin cần thiết về nhận biết đầy đủ về mẫu thử;