TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 7926 : 2008

THỰC PHẨM - PHÁT HIỆN SALMONELLA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SO MÀU NHANH SỬ DỤNG SÀNG LỌC CÓ TĂNG SINH CHỌN LỌC

Foodstuffs - Determination of salmonella by rapid colorimetric Immunoenrichment-based screening method

Lời nói đầu

TCVN 7926 : 2008 được xây dựng trên cơ sở AOAC 2000.07 Salmonella in Foods. Rapid Colorimetric Immunoenrichment-Based Screening Method;

TCVN 7926 : 2008 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỰC PHẨM - PHÁT HIỆN SALMONELLA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SO MÀU NHANH SỬ DỤNG SÀNG LỌC CÓ TĂNG SINH CHỌN LỌC

Foodstuffs - Determination of salmonella by rapid colorimetric Immunoenrichment-based screening method

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định Salmonella trong các sản phẩm thực phẩm bằng phương pháp so màu nhanh sử dụng sàng lọc có tăng sinh chọn lọc.

Tiêu chuẩn này không áp dụng cho các loại thực phẩm tươi sống.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi.

AOAC Official Method 967.26, Salmonella in Processed Foods

AOAC Official Method 967.27, Salmonella in Foods

AOAC Official Method 967.28, Salmonella in Foods

3. Nguyên tắc

Phép thử Salmonella Unique cung cấp tất cả các loại thuốc thử cần thiết cho một phép thử. Que nhúng được phủ các kháng thể thực hiện các bước tăng sinh miễn dịch và bước phát hiện (xem Hình 1).

Phép thử được bắt đầu bằng cách cho huyền phù thử nghiệm đã tăng sinh sơ bộ vào ống 1 cùng với que nhúng. Các kháng thể đặc hiệu đã tinh sạch trên bề mặt que nhúng sẽ bắt giữ chọn lọc mọi Salmonella có mặt. Sau khi rửa trong ống 2, que nhúng được chuyển vào ống 3 và được ủ ấm trong canh thang tăng sinh. Mọi Salmonella bị bắt giữ trên que nhúng được nhân lên đến mức có thể phát hiện được. Que nhúng sau đó được chuyển sang ống 4 có chứa các kháng thể liên kết (kết hợp) enzym đặc thù đối với Salmonella. Sự cộng hợp này sẽ liên kết mọi Salmonella vào que nhúng.

Rửa que nhúng trong ống 5 để loại bỏ hết liên kết thừa. Que nhúng sau đó được chuyển sang ống 6 có chứa chất nền đối với enzym. Nếu có mặt Salmonella thì sẽ xuất hiện màu tía ở nửa phía dưới của que nhúng. Nửa trên là phần kiểm chứng âm tính và giữ nguyên màu trắng. Nếu không có mặt tại Salmonella trong huyền phù thì que nhúng vẫn giữ nguyên màu trắng, trừ khi để kiểm chứng dương tính thì có màu tía pha tạp ở đáy que nhúng. Xác định các kết quả dương tính bằng cách so sánh với máy so màu, khi các vùng kiểm chứng âm tính và dương tính trên que nhúng cho các phản ứng màu như quy định.

Phương pháp này đưa ra quy trình sàng lọc đối với Salmonella có mặt trong tất cả các loại sản phẩm thực phẩm ngoại trừ các loại thực phẩm tươi sống. Phương pháp này không phải là phép thử khẳng định vì các kháng thể đa dòng được dùng trong phép thử có thể phản ứng chéo với một lượng nhỏ các vi sinh vật không phải là Salmonella. Các chủng canh thang từ các mẫu thử dương tính xác định bằng phương pháp này cần được ria cấy lên môi trường thạch chọn lọc như quy định trong AOAC 967.26B và các khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ cần được nhận dạng theo AOAC 967.26C và AOAC 967.28.

4. Thuốc thử và môi trường nuôi cấy

CẢNH BÁO AN TOÀN - Mọi que nhúng dương tính đều chứa các Salmonella sống. Do đó, cần tuân theo các quy định về thực hành an toàn trong phòng thử nghiệm vi sinh.

4.1. Yêu cầu chung

Các thuốc thử được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích và nước được sử dụng phải là nước cất hoặc nước cất có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác.

Các thành phần của bộ thử phải được sử dụng trong vòng 2 tháng sau khi mở túi đựng que nhúng và trước khi hết hạn sử dụng được ghi trên nhãn bên ngoài hộp. Ghi lại ngày mở túi đựng (ngày sử dụng đầu tiên) ngay trên hộp. Khi không sử dụng, để tất cả các thành phần trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 2 ^oC đến 8 ^oC, không làm đông lạnh. Các thành phần trong bộ thử được dùng như một đơn vị trọn vẹn. Các bộ và các que nhúng đã phủ các kháng thể mang cùng số mẻ được đánh dấu và không được sử dụng cho các phép thử của số mẻ khác. Trước khi sử dụng, đưa nhiệt độ của các thành phần của bộ thử đến khoảng từ 20 ^oC đến 25 ^oC.

4.2. Bộ thuốc thử, (TECRA, hoặc loại tương đương) gồm có:

- Ống 1: dung dịch đệm (200 ml), pH 8,5 chứa 283,1 g Tris trong 1000 ml nước.

- Ống 2: dung dịch rửa, nước đệm pepton cải biến (3,5 ml), được chuẩn bị như sau: Hòa tan vào 1000 ml nước 10 g pepton, 5 g NaCl, 7 g Na₂HPO₄ khan và 3 g KH₂PO₄. Trộn kỹ và phân phối vào các vật chứa thích hợp. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực ở 121 ^oC.

- Ống 3: canh thang M (1 ml), được chuẩn bị như sau: Hòa tan vào 1000 ml nước 5,0 g cao nấm men, 12,5 g trypton, 2,0 g D-mannoza, 5,0 g natri xitrat ngậm hai phân tử nước, 5,0 g NaCl, 5,0 g K₂HPO₄, 0,14 g MnCl₂.4H₂O, 0,8 g MgSO₄ khan, 0,04 g FeSO₄.7H₂O, 0,75 g Tween 80. Độ pH cuối cùng phải là 7,0 ± 0,2.

- Ống 4: dung dịch liên kết (1 ml), chứa các kháng thể anti-Salmonella (từ thịt cừu) được liên kết với phosphataza kiềm trong chất làm ổn định.

- Ống 5: dung dịch rửa (3,5 ml): trong 3,5 ml nước có chứa 0,006 g Tris [tris(hydroxymetyl) aminometan], 0,044 g NaCl, 0,0025 g Tween 20 và 0,005 g thimerosal.

- Ống 6: dung dịch chất nền (1 ml): 5-brom-4-clo-3-indolyl-phosphat p-intro blue tetrazoil clorua

- Que nhúng, được phủ các kháng thể được làm kín bằng dải hàn kín.

- Nắp đậy, để làm kín ống.

- Bảng so màu.

- Dung dịch nước đệm pepton cải biến.

5. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

5.1. Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ từ 35 ^oC đến 37 ^oC và từ 41 ^oC đến 43 ^oC.

5.2. Pipet, chia vạch 4 ml.

5.3. Giấy thấm.

6. Cách tiến hành

6.1. Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

Tiền tăng sinh: Xem chỉ dẫn của nhà sản xuất để xác định xem nếu sản phẩm cần thử nghiệm có các yêu cầu đặc biệt nào không. Nếu sản phẩm không có các yêu cầu đặc biệt, thì tăng sinh sản phẩm trong nước đệm pepton cải biến. Ủ ấm canh thang tăng sinh ở 35 ^oC đến 37 ^oC từ 16 h đến 20 h, trừ khi có quy định khác.

6.2. Phương pháp xác định

6.2.1. Trước khi sử dụng, đưa nhiệt độ của các thành phần của bộ thử đến khoảng từ 20 ^oC đến 25 ^oC.

6.2.2. Mỗi bộ thử cần dùng cho một mẫu thử. Dán nhãn kết thúc mỗi bộ thử với số nhận biết mẫu thử.

6.2.3. Bước 1: Bắt giữ

Mở túi đựng que nhúng và rút ra một que nhúng cho một mẫu thử. Đặt các que nhúng chưa sử dụng vào túi giấy gói có silica gel và làm kín lại bằng dải hàn kín.

Mở bao đựng nắp và đặt vào ống, mỗi bộ thử cần có sáu nắp đậy.

Tháo giấy gói ống 1 (xem Hình 1). Trộn kỹ huyền phù mẫu thử đã tăng sinh. Thêm huyền phù mẫu đã tăng sinh đến vạch 4 ml của ống trong bộ đã dán nhãn tương ứng. Lấy que nhúng ra khỏi ống chứa và vặn chặt ống 1. Giữ lại ống đựng que nhúng rỗng đễ sử dụng sau này. Trộn lượng chứa trong ống nhẹ nhàng bằng cách đảo chiều bộ thuốc thử.

Ủ ấm bộ thử ở 35 ^oC đến 37 ^oC tối thiểu trong 20 min, nhưng không quá 40 min.

Hình 1 - Bộ thuốc thử dùng trong phép thử Salmonella

6.2.4. Bước 2: Rửa

Tháo giấy gói ra khỏi ống 2, chuyển que nhúng vào ống này và vặn chặt ống xuống. Đậy nắp kín ống 1. Đảo chiều bộ thử hai lần để rửa que nhúng. Đảm bảo rằng bọt khí bị giữ lại thoát ra hết qua que nhúng khi đảo chiều.

6.2.5. Bước 3: Tái tạo

Tháo giấy gói ra khỏi ống 3, chuyển que nhúng vào ống này và vặn chặt ống xuống. Đậy nắp kín ống 2.

Ủ ấm bộ thử ở 35 ^oC đến 37 ^oC từ 4 h đến 5 h.

6.2.6. Bước 4: Liên kết

Tháo giấy gói ra khỏi ống 4, chuyển que nhúng vào ống này và vặn chặt ống xuống. Đậy nắp kín ống 3.

Ủ ấm bộ thử ở 35 ^oC đến 37 ^oC trong 30 min đến 40 min.

6.2.7. Bước 5: Rửa

Tháo giấy gói ra khỏi ống 5, chuyển que nhúng vào ống này và vặn chặt ống xuống. Đậy nắp kín ống 4.

Đảo chiều ống 5 hai lần để rửa que nhúng. Đảm bảo rằng bọt khí bị giữ lại thoát ra hết qua que nhúng khi đảo chiều.

6.2.8. Bước 6: Hiện màu

Tháo giấy gói ra khỏi ống 6, chuyển que nhúng vào ống này và vặn chặt ống xuống. Đậy nắp kín ống 5.

Ủ ấm bộ thử ở 20 ^oC đến 25 ^oC trong 10 min và đọc kết quả.

6.2.9. Bước 7: Đọc kết quả

Đặt giấy thấm hai lớp vào miếng giấy gói. Lấy que nhúng ra khỏi ống 6 và ấn nhẹ đầu cuối que vào giấy thấm để thấm hết chất nền còn dư.

Đọc kết quả sử dụng tấm bảng màu. Đậy nắp ống 6. Để que nhúng đến khô trên giấy thấm. Khi đã khô, đặt que nhúng trở lại ống chứa ban đầu để đối chứng sau này nếu cần. Giấy gói và giấy thấm có thể loại bỏ sau khi hấp áp lực.

Sử dụng bảng màu: mẫu thử được coi là dương tính khi có màu tía ở phần nửa dưới que nhúng và dải trắng ở nửa trên. Nếu màu xuất hiện yếu hoặc không đều, thì kết quả được coi là dương tính. Nếu toàn bộ que nhúng có màu tía thì hủy bỏ kết quả. Mẫu thử được coi là âm tính khi toàn bộ que nhúng có màu trắng, trừ phần nhỏ đi qua đáy có màu tía, phần này là kiểm chứng dương tính, nếu không có chứng tỏ đã có một bước bị bỏ sót và kết quả này không được sử dụng.

6.2.10. Khẳng định các mẫu dương tính

Kết quả dương tính trên que nhúng cho thấy có thể có mặt Salmonella. Tuy nhiên, vì các kháng thể có thể gây phản ứng chéo với một lượng nhỏ vi sinh vật khác, nên cần được khẳng định bằng cách ria cấy trên các đĩa hektoen enteric, xyloza lyzin desozycholat và bismuth sulfit từ canh thang trong ống 3.

7. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

- phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

- mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;

- các kết quả thử nghiệm thu được.