Giới thiệu chung về Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 9968:2013 (ISO 15884:2002)
Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 9968:2013 hoàn toàn tương đương với tiêu chuẩn quốc tế ISO 15884:2002, quy định phương pháp chuẩn bị metyl este của các axit béo từ chất béo sữa. Đây là một tiêu chuẩn kỹ thuật nền tảng trong lĩnh vực phân tích thực phẩm, phục vụ cho việc xác định thành phần axit béo bằng phương pháp sắc ký khí-lỏng (GLC).
Điều 1: Phạm vi áp dụng
Tiêu chuẩn này quy định chi tiết phương pháp chuẩn bị metyl este của các axit béo có nguồn gốc từ chất béo sữa. Phạm vi áp dụng cụ thể bao gồm:
- Áp dụng đối với chất béo sữa nguyên chất được tách chiết trực tiếp từ sữa tươi hoặc sữa đã qua xử lý.
- Áp dụng đối với chất béo thu được từ các sản phẩm sữa khác nhau như bơ, phô mai, kem, sữa bột và các sản phẩm béo từ sữa.
- Phương pháp này được thiết kế đặc biệt để xử lý các axit béo có mạch cacbon từ C4 đến C22, đảm bảo không làm mất các axit béo mạch ngắn dễ bay hơi (như axit butyric) trong quá trình chuẩn bị mẫu.
Điều 2: Tài liệu viện dẫn
Để áp dụng tiêu chuẩn này một cách chính xác và đồng bộ, cần tham chiếu đến các tài liệu viện dẫn quan trọng sau đây. Đối với các tài liệu ghi năm công bố thì áp dụng bản được nêu; đối với các tài liệu không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất:
- TCVN 6400 (ISO 707): Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu.
- ISO 14156 | IDF 172: Sữa và sản phẩm sữa - Phương pháp chiết lipid và các hợp chất hòa tan trong lipid (đây là tài liệu bắt buộc để thực hiện việc tách chiết chất béo trước khi tiến hành chuẩn bị metyl este).
Điều 3: Nguyên tắc của phương pháp
Phương pháp chuẩn bị metyl este của axit béo trong chất béo sữa dựa trên nguyên tắc chuyển este hóa (transesterification) trong môi trường kiềm khan, cụ thể:
- Hòa tan mẫu: Chất béo sữa được hòa tan hoàn toàn trong dung môi heptan để tạo thành một pha lỏng đồng nhất, tạo điều kiện thuận lợi cho phản ứng hóa học xảy ra.
- Phản ứng chuyển este hóa: Tiến hành phản ứng bằng cách thêm dung dịch kali hydroxit (KOH) trong metanol. Phản ứng diễn ra nhanh chóng ở nhiệt độ phòng, chuyển đổi các glyxerit (chất béo trung tính) thành các metyl este tương ứng của axit béo.
- Trung hòa và làm khan: Sử dụng natri hydro sunfat khan để trung hòa lượng kiềm dư thừa sau phản ứng và hấp thụ lượng nước phát sinh. Bước này cực kỳ quan trọng nhằm bảo vệ cột sắc ký khí khỏi bị hư hại và đảm bảo độ bền của thiết bị phân tích.
- Thu hồi mẫu: Lớp dung dịch heptan phía trên chứa các metyl este của axit béo được tách ra và sử dụng trực tiếp để bơm vào thiết bị sắc ký khí.
Điều 4: Thuốc thử và dung môi
Trong quá trình thực hiện phân tích, chỉ sử dụng các thuốc thử đạt độ tinh khiết phân tích cao và nước cất hoặc nước có độ tinh khiết tương đương để tránh gây nhiễu kết quả sắc ký:
- Heptan: Dung môi chính dùng để hòa tan chất béo, yêu cầu không chứa các tạp chất hữu cơ có thể gây nhiễu trên sắc ký đồ.
- Dung dịch Kali hydroxit trong metanol (nồng độ khoảng 2 mol/l): Được chuẩn bị bằng cách hòa tan kali hydroxit khan trong metanol tuyệt đối. Dung dịch này cần được bảo quản trong chai thủy tinh tối màu, đậy kín và chuẩn bị mới định kỳ để tránh hút ẩm từ không khí.
- Natri hydro sunfat ngậm một phân tử nước (NaHSO4.H2O): Dạng bột mịn, được sấy khô và sử dụng để trung hòa kiềm dư và làm khan dung dịch sau phản ứng chuyển este hóa.
CHẤT BÉO SỮA - CHUẨN BỊ METYL ESTE CỦA AXIT BÉO
Milk fat - Preparation of fatty acid methyl esters
Lời nói đầu
TCVN 9968:2013 hoàn toàn tương đương với ISO 15884:2002;
TCVN 9968:2013 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn và Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.
CHẤT BÉO SỮA - CHUẨN BỊ METYL ESTE CỦA AXIT BÉO
Milk fat - Preparation of fatty acid methyl esters
Tiêu chuẩn này quy định phương pháp chuẩn bị metyl este của axit béo trong chất béo sữa (milk fat) và chất béo thu được từ các sản phẩm sữa.
Phương pháp này không thích hợp để phân tích chất béo sữa đã phân giải lipit từng phần (độ axit của chất béo > 1 mmol axit béo tự do trên 100 g chất béo). Trong trường hợp này, có thể sử dụng phương pháp khác nêu trong Phụ lục A
Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).
TCVN 5504 (ISO 2446), Sữa - Xác định hàm lượng chất béo.
TCVN 8103 (ISO 14156), Sữa và sản phẩm sữa - Phương pháp chiết lipit và các hợp chất hòa tan trong lipit.
TCVN 9969 (ISO 15885), Chất béo sữa - Xác định thành phần của axit béo bằng sắc ký khí lỏng.
Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:
3.1. Metyl este của các axit béo trong chất béo sữa (fatty acit methyl esters of milk fat)
Các metyl este của các axit béo được chuẩn bị bằng quy trình quy định trong tiêu chuẩn này.
Các metyl este của các axit béo trong chất béo sữa được chuẩn bị bằng metanol phân các glycerit có xúc tác kiềm trong dung dịch không chứa rượu. Sau thời gian phản ứng nhất định, trung hòa hỗn hợp bằng cách thêm natri hydro sulfat tinh thể để tránh xà phòng hóa các este tạo thành.
Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước đã loại khoáng hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác.
5.1. Dung môi: n-pentan, n-hexan hoặc n-heptan.
5.2. Metanol, chứa không quá 0,5 % khối lượng nước.
5.3. Natri hydro sulfat ngậm một phân tử nước (NaHSO4.H2O).
5.4. Thuốc thử chuyển hóa este, dung dịch kali hydroxit (KOH) hoặc dung dịch natri methoxit (NaOCH3) trong metanol xấp xỉ 2 mol/l.
Hòa tan 11,2 g KOH trong 100 ml metanol và trộn kỹ.
Cách khác, hòa tan 10,8 g NaOCH3 trong 100 ml metanol và trộn kỹ.
Dung dịch natri methoxit trong metanol có thể được chuẩn bị bằng cách hòa tan 4,6 g natri kim loại trong metanol hoặc pha loãng dung dịch bán sẵn trên thị trường đến nồng độ khoảng 5,4 mol/l (ví dụ: Fluka 717481)). Tuy nhiên, phải rất cẩn thận khi xử lý với natri kim loại.
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
6.1. Cân, có thể cân chính xác đến 1 mg.
6.2. Ống nghiệm, đường kính 16 mm, dài 100 mm, có nắp vặn lót bằng PTFE.
6.3. Pipet chia vạch, dung tích 1 ml và 10 ml.
6.4. Máy trộn vortex.
6.5. Máy ly tâm, có thể vận hành ở 350 g ± 50 g.
Máy ly tâm cần có bộ phận hiển thị tốc độ số vòng quay trên phút, với dung sai tối đa là ± 50 r/min. Về chi tiết, xem TCVN 5504 (ISO 2446).
Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc không bị thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.
Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707).
Thực hiện phương pháp chiết theo TCVN 8103 (ISO 14156).
Chất béo chiết được có thể bảo quản trong tủ lạnh đông không quá 1 tháng.
Cân 100 mg mẫu thử đã chuẩn bị (Điều 8), chính xác đến 5 mg, cho vào ống nghiệm (6.2). Hòa tan phần mẫu thử trong 5 ml dung môi (5.1) và trộn. Thêm 0,2 ml thuốc thử chuyển hóa este (5.4) và đậy nắp ống nghiệm.
Trộn mạnh lượng chứa trong ống nghiệm trên máy trộn vortex (6.4) trong 1 min. Sau thời gian phản ứng thêm 5 min, thì bổ sung 0,5 g natri hydro sulfat rắn (5.3) và trộn lại. Đặt các ống nghiệm đựng mẫu thử vào máy ly tâm (6.5) và cho ly tâm 3 min ở nhiệt độ phòng.
Sau khi ly tâm, lấy phần dịch lỏng trong suốt phía trên của phần mẫu thử để phân tích sắc ký khí lỏng. Tiến hành theo quy định trong TCVN 9969 (ISO 15885).
Nếu cần, gạn lấy dung dịch este và bảo quản trong tủ lạnh hoặc tốt nhất là bảo quản trong tủ đông sâu trong vài ngày. Phải chú ý để tránh làm thất thoát do metyl este của các axit béo trong chất béo sữa bay hơi.
CHÚ THÍCH: Các N-acyl lipit (ví dụ: sphingolipit) không chuyển hóa este bằng cách metanol phân với xúc tác kiềm. Các chất này chủ yếu xuất hiện trong chất béo là sản phẩm từ whey.
Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:
a) tất cả các thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
c) phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;
d) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy chọn cũng như các sự cố bất kỳ có thể ảnh hưởng đến kết quả thử.
(Quy định)
Quy trình thay thế sử dụng sự chuyển hóa este có xúc tác axit của các glycerit
A.1 Giới thiệu
Nếu chất béo sữa thủy phân từng phần được chuyển thành các metyl este axit béo thì sử dụng xúc tác axit chuyển hóa este của các liên kết axit glyxerit đồng thời với este hóa các axit béo tự do quy định trong Phụ lục này.
A.2 Thuốc thử
Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước đã loại khoáng hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác.
A.2.1 Axit sulfuric, ρ20(H2SO4) = 1,84 g/ml.
A.2.2 Metanol, chứa không quá 0,5 % khối lượng nước.
A.2.3 Thuốc thử chuyển hóa este
Trong khi làm nguội, thêm từ từ 1 ml axit sulfuric (A.2.1) vào 15 ml metanol (A.2.2).
A.3 Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:
A.3.1 Cân, có thể cân chính xác đến 10 mg.
A.3.2 Pipet chia vạch, dung tích 1 ml và 5 ml.
A.3.3 Ống thủy tinh, dung tích 5 ml.
Để thay cho các ống thủy tinh, có thể sử dụng các lọ tạo dẫn xuất nhỏ thích hợp có kích thước tương tự, với điều kiện là kín khí để tránh làm thất thoát các este bay hơi.
A.3.4 Tủ sấy, có thể làm việc ở nhiệt độ từ 100 oC đến 110 oC hoặc nồi cách thủy đun sôi.
A.4 Chuẩn bị mẫu thử
Chuẩn bị mẫu thử theo Điều 8.
A.5 Cách tiến hành
Cân 2 g mẫu thử đã chuẩn bị, chính xác đến 10 mg, cho vào ống thủy tinh (A.3.3). Thêm 0,4 ml thuốc thử chuyển hóa este (A.2.3). Làm kín ống thủy tinh trên ngọn lửa. Giữ ống thủy tinh chứa mẫu 3 h trong tủ (A.3.4) ở 100 oC đến 110 oC, thỉnh thoảng xoay trộn mẫu chứa trong ống.
Làm nguội ống thủy tinh chứa mẫu đến nhiệt độ phòng và để cho tách pha hoàn toàn. Mở ống thủy tinh và lấy phần nổi phía trên để phân tích. Nên pha loãng các este tạo thành với dung môi thích hợp.
THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu.
1) Fluka là tên thương mại của thuốc thử có bán sẵn. Thông tin đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng sản phẩm này.
- 1 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8103:2009 (ISO 14156 : 2001/AMD 1 : 2007) về Sữa và sản phẩm sữa - Phương pháp chiết lipit và các hợp chất hòa tan trong lipit
- 2 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 5504:2010 (ISO 2446:2008/IDF 226:2008) về Sữa - Xác định hàm lượng chất béo
- 3 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 6400:2010 (ISO 707:2008/IDF 50:2008) về Sữa và các sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu
- 4 Tiêu chuẩnh quốc gia TCVN 9969:2013 (ISO 15885:2002) về Chất béo sữa – Xác định thành phần của axit béo bằng sắc ký khí lỏng
- 1 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8475:2010 (ISO 23065:2009) về Chất béo sữa từ các sản phẩm sữa - Xác định hàm lượng axit béo omega-3 và omega-6 bằng sắc kí khí-lỏng
- 2 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8434:2010 (CODEX STAN 280-1973, REV.1-1999, AMD.1-2006) về Sản phẩm chất béo sữa
- 3 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7728:2007 (ISO 5536:2002) về Sản phẩm chất béo sữa - Xác định hàm lượng nước - Phương pháp Karl Fischer
- 4 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9970:2013 (ISO 12078:2006) về Chất béo sữa dạng khan – Xác định thành phần sterol bằng sắc ký khí lỏng (Phương pháp chuẩn)
- 5 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9971:2013 (ISO 18252:2006) về Chất béo sữa dạng khan – Xác định thành phần sterol bằng sắc ký khí lỏng (Phương pháp thông dụng)
- 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10126:2013 (CODEX STAN 256-2007, Amd. 2009) về Chất béo dạng phết và hỗn hợp chất béo dạng phết
- 7 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10557:2015 (CODEX STAN 253-2006 WITH AMENDMENT 2010) về Chất béo sữa dạng phết
- 1 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8475:2010 (ISO 23065:2009) về Chất béo sữa từ các sản phẩm sữa - Xác định hàm lượng axit béo omega-3 và omega-6 bằng sắc kí khí-lỏng
- 2 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8434:2010 (CODEX STAN 280-1973, REV.1-1999, AMD.1-2006) về Sản phẩm chất béo sữa
- 3 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7728:2007 (ISO 5536:2002) về Sản phẩm chất béo sữa - Xác định hàm lượng nước - Phương pháp Karl Fischer
- 4 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8103:2009 (ISO 14156 : 2001/AMD 1 : 2007) về Sữa và sản phẩm sữa - Phương pháp chiết lipit và các hợp chất hòa tan trong lipit
- 5 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 5504:2010 (ISO 2446:2008/IDF 226:2008) về Sữa - Xác định hàm lượng chất béo
- 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 6400:2010 (ISO 707:2008/IDF 50:2008) về Sữa và các sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu
- 7 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9970:2013 (ISO 12078:2006) về Chất béo sữa dạng khan – Xác định thành phần sterol bằng sắc ký khí lỏng (Phương pháp chuẩn)
- 8 Tiêu chuẩnh quốc gia TCVN 9969:2013 (ISO 15885:2002) về Chất béo sữa – Xác định thành phần của axit béo bằng sắc ký khí lỏng
- 9 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9971:2013 (ISO 18252:2006) về Chất béo sữa dạng khan – Xác định thành phần sterol bằng sắc ký khí lỏng (Phương pháp thông dụng)
- 10 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10126:2013 (CODEX STAN 256-2007, Amd. 2009) về Chất béo dạng phết và hỗn hợp chất béo dạng phết
- 11 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10557:2015 (CODEX STAN 253-2006 WITH AMENDMENT 2010) về Chất béo sữa dạng phết