TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8400-59:2026

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 59: BỆNH CÚM GIA CẦM A/H9N2

Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 59: Avian influenza A/H9N2

Lời nói đầu

TCVN 8400-59:2026 do Trung tâm Chẩn đoán và Xét nghiệm thú ý Trung ương I - Cục Chăn nuôi và Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Môi trường đề nghị, Ủy ban Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng Quốc gia thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ TCVN 8400 Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán gồm các phần sau:

- TCVN 8400-1:2019, Phần 1: Bệnh lở mồm long móng;

- TCVN 8400-2:2010, Phần 2: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra trên lợn;

- TCVN 8400-3:2010, Phần 3: Bệnh giun xoắn;

- TCVN 8400-4:2010, Phần 4: Bệnh Niu cát xơn;

- TCVN 8400-5:2011, Phần 5: Bệnh tiên mao trùng;

- TCVN 8400-6:2011, Phần 6: Bệnh xuất huyết thô;

- TCVN 8400-7:2011, Phần 7: Bệnh đậu cừu và đậu dê;

- TCVN 8400-8:2011, Phần 8: Bệnh nấm phổi do Aspergillus ở gia cầm;

- TCVN 8400-9:2011, Phần 9: Bệnh viêm gan vịt typ I;

- TCVN 8400-10:2022, Phần 10: Bệnh lao bò;

- TCVN 8400-11:2019 Phần 11: Bệnh dịch tả vịt;

- TCVN 8400-12:2011, Phần 12: Bệnh bạch lỵ và thương hàn ở gà;

- TCVN 8400-13:2019, Phần 13: Bệnh sảy thai truyền nhiễm do Brucella;

- TCVN 8400-14:2011, Phần 14: Bệnh tụ huyết trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-15:2019, Phần 15: Bệnh xoắn khuẩn do Leptospira;

- TCVN 8400-16:2011, Phần 16: Bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E. coli;

- TCVN 8400-17:2011, Phần 17: Bệnh do Staphylococcus aureus ở gà;

- TCVN 8400-18:2014, Phần 18: Bệnh phù đầu gà (coryza);

- TCVN 8400-19:2014, Phần 19: Bệnh phó thương hàn lợn;

- TCVN 8400-20:2014, Phần 20: Bệnh đóng dấu lợn;

- TCVN 8400-21:2014, Phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS);

- TCVN 8400-22:2014 Phần 22: Bệnh giả dại ở lợn;

- TCVN 8400-23:2014, Phần 23: Bệnh ung khí thán;

- TCVN 8400-24:2014, Phần 24: Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm;

- TGVN 8400-25:2014, Phần 25: Bệnh cúm lợn;

- TCVN 8400-26:2014, Phần 26: Bệnh cúm gia cầm H5N1;

- TCVN 8400-27:2014, Phần 27: Bệnh sán lá gan;

- TCVN 8400-28:2014, Phần 28: Bệnh viêm ruột hoại tử do Clostridium perfringens;

- TCVN 8400-29:2015, Phần 29: Bệnh Lympho leuko ở gà;

- TCVN 8400-30:2015, Phần 30: Bệnh Marek ở gà;

- TCVN 8400-31:2015, Phần 31: Bệnh tụ huyết trùng gia cầm;

- TCVN 8400-32:2015, Phần 32: Bệnh Gumboro ở gia cầm;

- TCVN 8400-33:2015, Phần 33: Bệnh lê dạng trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-34:2015, Phần 34: Bệnh biên trùng ở trâu bò;

- TCVN 8400-35:2015, Phần 35: Bệnh Theileria ở trâu bò;

-TCVN 8400-36:2015, Phần 36: Hội chứng suy mòn ở lợn sau cai sữa do Circo virus typ 2;

- TCVN 8400-37:2015, Phần 37: Bệnh viêm phổi địa phương ở lợn;

- TCVN 8400-38:2015, Phần 38: Bệnh tiêu chảy ở lợn do Corona virus;

- TCVN 8400-39:2016, Phần 39: Bệnh viêm đường hô hấp mãn tính ở gà;

- TCVN 8400-40:2016, Phần 40: Bệnh nhiễm trùng huyết ở thủy cầm do vi khuẩn Reimerella anatipestifer gây ra;

-TCVN 8400-41:2019, Phần 41: Bệnh dịch tả lợn châu Phi;

- TCVN 8400-42:2019, Phần 42: Bệnh dịch tả loài nhai lại nhỏ;

- TCVN 8400-43:2019, Phần 43: Bệnh lưỡi xanh;

- TCVN 8400-44:2019, Phần 44: Bệnh roi trùng Trichomonosis;

- TCVN 8400-45:2019, Phần 45: Bệnh gạo lợn, bệnh gạo bò;

- TCVN 8400-46:2019, Phần 46: Bệnh dại;

- TCVN 8400-47:2019, Phần 47: Bệnh dịch tả lợn cổ điển;

- TCVN 8400-48:2020, Phần 48: Bệnh tiêu chảy có màng nhày do vi rút ở bò;

- TCVN 8400-49:2020, Phần 49: Bệnh viêm mũi khí quản truyền nhiễm ở bò;

- TCVN 8400-50: 2020, Phần 50: Bệnh viêm não Nhật Bản;

- TCVN 8400-51:2020, Phần 51: Bệnh viêm phổi, màng phổi truyền nhiễm ở bò;

- TCVN 8400-52:2022, Phần 52: Bệnh nhiệt thán ở gia súc;

- TCVN 8400-53:2022, Phần 53: Bệnh viêm phổi hóa mủ do vi khuẩn Ornithobacterium rhinotracheale ở gà;

- TCVN 8400-54:2022, Phần 54: Bệnh tỵ thư ở gia súc;

- TCVN 8400-55:2022, Phần 55: Bệnh u nhày ở thỏ;

- TCVN 8400-56:2023, Phần 56: Bệnh tụ huyết trùng ở lợn, trâu, bò, gia cầm;

- TCVN 8400-57:2024, Phần 57: Bệnh Glasser ở lợn;

- TCVN 8400-58:2026, Phần 58: Bệnh viêm da nổi cục ở trâu, bò;

- TCVN 8400-59:2026, Phần 59: Bệnh cúm gia cầm A/H9N2;

- TCVN 8400-60:2026, Phần 60: Bệnh rụt mỏ ở thủy cầm;

BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN - PHẦN 59: BỆNH CÚM GIA CẦM A/H9N2

Animal diseases - Diagnostic procedure - Part 59: Avian influenza A/H9N2

CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đưa ra hết các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập các thao tác an toàn sinh học thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn này.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh cúm gia cầm do vi rút cúm A/H9N2 thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra.

2  Tài liệu viện dẫn

Tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các bản sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 8402:2010. Bệnh động vật - Quy trình mổ khám.

3  Thuật ngữ và định nghĩa, các từ viết tắt

3.1.  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

Bệnh cúm gia cầm (Avian influenza)

Bệnh cúm gia cầm (CGC) là bệnh truyền nhiễm do vi rút cúm type A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra trên các loài gia cầm, thủy cầm và chim hoang dã, có khả năng truyền lây sang người và động vật. Dựa vào độc lực của vi rút cúm gia cầm các nhà khoa học xếp loại: bệnh cúm gia cầm độc lực cao (HPAI) có tỷ lệ chết rất cao và cúm gia cầm độc lực thấp (LPAI) với triệu chứng bệnh không rõ rệt và tỷ lệ chết thấp.

Vi rút cúm gia cầm (Avian influenza virus)

Vi rút cúm gia cầm (CGC) thuộc vi rút cúm type A, hệ gen của vi rút bao gồm 8 đoạn ARN sợi đơn âm (ssRNA). Vi rút được phân chia thành nhiều subtype khác nhau dựa trên hai glycoprotein bề mặt là HA (Haemagglutinin) và NA (Neuramindases). Nhóm vi rút cúm A có 18 subtype HA (từ H1 đến H18) và 11 subtype NA (từ N1 đến N11). Sự tổ hợp giữa các subtype HA và NA sẽ tạo ra các subtype vi rút khác nhau, có khả năng biến đổi rất nhanh, tạo ra những chủng mới, nhánh mới.

Vi rút cúm A/H9N2 là vi rút cúm gia cầm type A, subtype H9N2 thường được biết đến là vi rút cúm gia cầm độc lực thấp (LPAI) thường không có triệu chứng bệnh hoặc có rất ít triệu chứng.

3.2  Từ viết tắt

- ARN (Acid ribonucleic): Axit ribonucleic;

- CGC: Cúm gia cầm;

- Ct (Threshold cycle): Chu kỳ ngưỡng;

- DNase (Deoxyribonuclease): Enzyme thủy phân liên kết của phân tử axit deoxyribonucleic;

- HA (Haemagglutination assay): Phản ứng ngưng kết hồng cầu;

- HI (Haemagglutination inhibition assay): Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu;

- HPAI (Highly pathogenic avian influenza): Cúm gia cầm độc lực cao;

- LPAI (Lowly pathogenic avian influenza): Cúm gia cầm độc lực thấp;

- PBS (Phosphate buffered saline): Dung dịch muối đệm phốt phát;

- Real-time RT-PCR (Real-time reverse transcription - Polymerase chain reaction): Phản ứng chuỗi trùng hợp phiên mã ngược thời gian thực;

- RNase (Ribonuclease): Enzyme thủy phân liên kết của phân tử axit ribonucleic;

- SAN (Specific antibody negative): Âm tính kháng thể đặc hiệu;

- SPF (Specific pathogen free): Không có tác nhân gây bệnh;

- ssRNA (single-stranded Acid ribonucleic): Axit ribonucleic sợi đơn;

- TE (Tris-EDTA): Tris - Ethylenediaminetetraacetic acid;

4  Thuốc thử, vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích; sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có DNase/RNase, trừ các trường hợp có quy định khác.

4.1  Thuốc thử, vật liệu thử dùng chung

4.1.1  Ethanol, từ 70 % (v/v) đến tuyệt đối.

4.1.2  Dung dịch muối đệm phốt phát (PBS), pH 7,4 ±0,2 (xem A.1, phụ lục A)

4.2  Thuốc thử, vật liệu thử dùng cho phương pháp real-time RT-PCR

4.2.1  Nguyên liệu tách chiết ARN.

4.2.2  Nguyên liệu nhân gen cho phản ứng real-time RT-PCR.

4.2.3  Cặp mồi, mẫu dò cho phản ứng real-time RT-PCR.

4.2.4  Dung dịch đệm TE, pH = 8,0.

4.2.5  Nước cất hoặc nước khử khoáng, hoặc nước tinh khiết, không có DNase/RNase.

4.2.6  Mẫu chuẩn dương, được chứng nhận là dương tính hoặc ARN chuẩn dương tách chiết từ mẫu chuẩn dương.

4.3  Thuốc thử, vật liệu thử dùng cho phương pháp phân lập, HA, HI

4.3.1  Trứng gà có phôi 9-11 ngày tuổi SPF hoặc SAN.

4.3.2 Natri Citrate (Na₃C₆H₅O₇).

4.3.3 Hồng cầu gà (gà khỏe mạnh không chứa kháng thể cúm hoặc các kháng thể gây ngưng kết hồng cầu và vi rút cúm gia cầm) có tỷ trọng hồng cầu đạt khoảng 30 % - 45 %.

4.3.4  Kháng nguyên chuẩn subtype H9N2.

4.3.5  Kháng huyết thanh chuẩn subtype H9N2.

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm và cụ thể như sau:

5.1  Thiết bị, dụng cụ dùng chung

5.1.1  Máy nghiền mẫu.

5.1.2  Ống vô trùng, dung tích 1,5 ml, 15 ml, 50 ml.

5.1.3  Máy lắc trộn vortex.

5.1.4  Máy ly tâm, có thể ly tâm với gia tốc từ 1 500 g đến 12 000 g.

5.1.5  Máy ly tâm lắng spindown.

5.1.6  Nồi hấp vô trùng, có thể duy trì ở nhiệt độ 110 °C, 121 °C.

5.1.7  Tủ an toàn sinh học cấp II, cấp III.

5.1.8  Tủ lạnh, có thể duy trì ở nhiệt độ 2°C đến 8°C.

5.1.9  Tủ lạnh âm sâu, có thể duy trì ở nhiệt độ âm 20°C đến âm 80 °C.

5.1.10  Panh và kéo, vô trùng.

5.1.11  Micropipet có thể hút được dung tích 0,5-10 µl; 1 - 30 µl; 20 - 200 µl; 100-1 000 µl;

5.1.12  Đầu tip các loại, phù hợp với Micropipet.

5.1.13  Tăm bông, vô trùng.

5.1.14  Túi nylon vô trùng.

5.1.15  Ống nghiền mẫu.

5.1.16.  Bộ bảo hộ cá nhân.

5.2  Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp real-time RT-PCR

5.2.1  Máy tách chiết ARN/ADN

5.2.2  Ống ly tâm, dung tích 1,5 ml đến 2 ml, không chứa DNase/RNase.

5.2.3  Máy real-time PCR

5.2.4  Ống PCR, 0,1 đến 0,2 ml, không chứa DNase/RNase.

5.3  Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp phân lập, HA, HI

5.3.1  Tủ ấp trứng.

5.3.2  Màng lọc vô trùng 0,45 µm

5.3.3  Bơm tiêm vô trùng có dung tích 1 ml, 5 ml, 10 ml

5.3.4  Kim tiêm vô trùng loại 23G và 20G.

5.3.5  Đĩa 96 giếng vô trùng đáy chữ V.

5.3.6  Máy ủ nhiệt.

6  Chẩn đoán lâm sàng

6.1  Dịch tễ học

Bệnh cúm gia cầm có tính lây truyền rất nhanh và mạnh. Gia cầm nhiễm bệnh chủ yếu thông qua tiếp xúc trực tiếp giữa gia cầm mẫn cảm với gia cầm bị bệnh hoặc phân, chất thải, bề mặt vật dụng nhiễm phân chất thải của gia cầm bị bệnh. Gia cầm cũng có thể nhiễm bệnh gián tiếp qua đường không khí thông qua việc hít phải các giọt nhỏ dịch tiết hoặc bụi phân khô của gia cầm bị bệnh.

Tùy thuộc vào loài mẫn cảm, lứa tuổi, loại gia cầm, yếu tố môi trường và độc lực của vi rút gây bệnh mà gia cầm khi nhiễm bệnh có biểu hiện các thể bệnh khác nhau:

- Thể độc lực cao: tỷ lệ mắc bệnh và tử vong cao có thể đến 100 % đối với gà trong thời gian 2 ngày đến 3 ngày kể từ khi xuất hiện triệu chứng đầu tiên, tỷ lệ chết ở vịt là > 70 % và ở ngỗng là > 50 %.

- Thể độc lực thấp: thường gây bệnh lý nhẹ hoặc không có biểu hiện bệnh lý lâm sàng, gia cầm dễ bội nhiễm cùng các bệnh gây ra do vi rút hoặc vi khuẩn khác, tỷ lệ chết thường thấp khoảng 2 % - 3 % đối với gà và không gây chết với vịt.

Cúm gia cầm A/H9N2 thường được biết đến là CGC độc lực thấp (LPAI) lưu hành trên toàn thế giới và có thời gian lưu hành lâu dài trong các quần thể gia cầm ở Châu Á, Châu Phi và Trung Đông. Các loài chim nước hoang dã được coi là nguồn chứa vi rút. Chúng thường không có triệu chứng và mang trùng vi rút quanh năm, tỷ lệ mắc bệnh của quần thể có thể tăng lên theo mùa di cư.

6.2  Triệu chứng lâm sàng

Cúm gia cầm A/H9N2 thường không gây ra các triệu chứng lâm sàng rõ rệt hoặc có rất ít triệu chứng không như bệnh gây ra bởi cúm gia cầm thể độc lực cao subtype H5 và H7. Một số triệu chứng của cúm A/H9N2 được ghi nhận trên gà:

- Giảm tiêu thụ thức ăn và nước, mệt mỏi, lờ đờ, lông xù, ho, hắt hơi.

- Giảm sản lượng trứng, trứng bị biến dạng.

- Tím tái nhẹ ở mào và yếm.

- Giảm tăng trọng.

Trên vịt và ngỗng: không có biểu hiện lâm sàng.

6.3  Bệnh tích

Một số bệnh tích của cúm A/H9N2 được ghi nhận như sau:

Trên gà:

- Tổn thương đại thể chỉ thấy ở hệ hô hấp, có tình trạng đục túi khí ngực và bụng, kèm tắc nghẽn nhẹ ở khí quản và phổi.

- Viêm nhiễm trùng lỗ mũi, chảy dịch nhiều ở mắt.

- Viêm nhẹ ống dẫn trứng và viêm buồng trứng.

- Có tổn thương bệnh mô học ở khí quản, phổi với tình trạng viêm lympho, viêm phổi kẽ.

Trên vịt và ngỗng: không có biểu hiện bệnh lý.

7  Chẩn đoán trong phòng thử nghiệm

Để chẩn đoán phát hiện bệnh cúm gia cầm A/H9N2 thực hiện theo sơ đồ chẩn đoán bệnh CGC A/H9N2 (tham khảo phụ lục G).

7.1  Lấy mẫu, bảo quản và xử lý mẫu

7.1.1  Lấy mẫu

Lấy mẫu theo hướng dẫn quy trình mổ khám TCVN 8402:2010.

- Mẫu xét nghiệm là mô nội tạng (ưu tiên các mẫu đường hô hấp như phổi, khí quản,...), dịch ngoáy hầu họng, khí quản, ổ nhớp, phân tươi, huyết thanh.

- Với gia cầm chết hoặc nghi mắc bệnh lấy 3 gam đến 5 gam bệnh phẩm (ưu tiên mẫu nội tạng đường hô hấp như phổi, khí quản,...) cho vào ống vô trùng 50 ml (5.1.2) hoặc túi nylon vô trùng (5.1.14).

- Với gia cầm sống không có triệu chứng dùng tăm bông vô trùng (5.1.13) để ngoáy dịch hầu họng, ổ nhớp (swab) sau đó cho vào ống vô trùng 15ml (5.1.2) chứa dung dịch bảo quản ví dụ như PBS (xem A.1, phụ lục A).

- Mẫu huyết thanh: thực hiện đối với gia cầm chưa tiêm vắc xin cúm gia cầm và cả gia cầm đã được tiêm phòng vắc xin cúm gia cầm: lấy máu bằng, cách sử dụng bơm và kim tiêm loại 5 ml (5.3.3) để hút 1 ml máu của động vật cần kiểm tra, rút cán bơm tiêm tới mức cao nhất để tạo nhiều khoảng trống bên trong, đặt bơm tiêm, nằm nghiêng 5° ở nhiệt độ 20 °C đến 30 °C trong thời gian 30 phút để máu tự đông lại và tiết ra huyết thanh.

7.1.2  Bảo quản mẫu

- Tất cả các mẫu bệnh phẩm (xem 7.1.1) phải được dán nhãn, có ký hiệu phù hợp và kèm theo các thông tin dịch tễ, triệu chứng lâm sàng và bệnh tích của bệnh (nếu mổ khám).

Các mẫu bệnh phẩm được bảo quản trong túi nylon hoặc lọ đựng bệnh phẩm vô trùng, tất cả được đặt trong thùng bảo ôn và vận chuyển trong điều kiện lạnh từ 2 °C đến 8 °C. Mẫu bệnh phẩm gửi đến phòng, thử nghiệm sớm nhất (≤ 48 giờ) bằng phương tiện vận chuyển đảm bảo không ảnh hưởng đến chất lượng mẫu và kèm theo phiếu gửi bệnh phẩm.

- Đối với mẫu mô và mẫu swab để phát hiện vi rút và phân lập vi rút, nếu trường hợp mẫu vận chuyển trên quãng đường dài không thể bảo quản lạnh thì môi trường bảo quản cần bổ sung 10 % glycerol.

- Mẫu huyết thanh bảo quản ở nhiệt độ 2 °C đến 8 °C tối đa trong 7 ngày.

- Mẫu bệnh phẩm lưu trong thời gian dài cần được bảo quản ở nhiệt độ âm 80 °C (5.1.9).

CHÚ THÍCH: Các mẫu bệnh phẩm là mẫu làm xét nghiệm chỉ tiêu về kháng thể thì không được làm đông lạnh hoặc để bên ngoài quá lâu vì hồng cầu sẽ tự phá hủy. Trường hợp mẫu huyết thanh đã ly tâm tách hết thành phần hữu cơ thì bảo quản như trên.

7.1.3  Xử lý mẫu

Mẫu bệnh phẩm (xem 7.1.1) được xử lý tại phòng thử nghiệm như sau:

- Mẫu mô bệnh phẩm

Cắt nhỏ 1g mẫu mô bệnh phẩm (phổi, khí quản...) bằng panh, kéo (5.1.10), đồng nhất bằng ống nghiền mẫu (5.1.15) với dung dịch PBS (xem A.1, phụ lục A) theo tỷ lệ 1:10 để tạo huyễn dịch 10%. Chuyển sang ly tâm (5.1.4) ở 8 000 g trong 15 giây.

Thu dịch bệnh phẩm phía trên vào ít nhất 02 ống nghiệm 1,5 ml (5.1.2). Một ống dùng cho xét nghiệm và ống còn lại lưu bảo quản ở nhiệt độ âm 80 °C (5.1.9).

- Dịch ngoáy ổ nhớp, họng, khí quản, phân

Lắc ống chứa tăm bông dịch ngoáy hầu họng, ổ nhớp (swab) bằng máy lắc (5.1.3) trong 15 giây, ly tâm ống bằng máy ly tâm (5.1.4) ở 8 000 g trong 15 giây.

Thu dịch bệnh phẩm phía trên vào ít nhất 02 ống nghiệm 1,5 ml (5.1.2). Một ống dùng cho xét nghiệm và ống còn lại lưu bảo quản ở nhiệt độ âm 80 °C (5.1.9).

- Mẫu huyết thanh: sau khi lấy máu của động vật cần kiểm tra (7.1.1) đặt bơm tiêm nằm nghiêng 5° ở nhiệt độ 20 °C đến 30 °C trong thời gian 30 phút để máu tự đông lại và tiết ra huyết thanh. Trong trường hợp mẫu máu không tự tiết ra huyết thanh thì chuyển hết mẫu máu vào ống nghiệm 1,5 ml (5.1.2), ly tâm ống bằng máy ly tâm (5.1.4) ở 8 000 g trong 15 giây để tách huyết thanh. Tách lấy huyết thanh chuyển sang 02 ống nghiệm 1,5 ml (5.1.2). Một ống dùng cho xét nghiệm và ống còn lại lưu bảo quản ở nhiệt độ ẩm 80 °C (5.1.9).

7.2  Phát hiện vi rút

7.2.1  Phương pháp real-time RT-PCR

Để phát hiện vi rút CGC A/H9N2 bằng phương pháp real-time RT-PCR gồm 2 bước sau:

- Bước 1: Phát hiện vi rút CGC type A bằng phương pháp real-time RT-PCR sử dụng cặp mồi, mẫu dò xác định type A (gen Matrix - M) (tham khảo bảng C.1, phụ lục C).

- Bước 2: Các mẫu dương tính với vi rút CGC type A tiếp tục được thực hiện phương pháp real-time RT-PCR sử dụng cặp mồi, mẫu dò xác định subtype H9 và subtype N2 (tham khảo bảng C.1, phụ lục C).

7.2.1.1  Tách chiết ARN

- Sau khi xử lý mẫu, thu lấy dịch bệnh phẩm phía trên (7.1.3) để tách chiết ARN bằng máy tách chiết (5.2.1).

Căn cứ điều kiện phòng thử nghiệm và loại mẫu bệnh phẩm để lựa chọn kĩ thuật và nguyên liệu tách chiết ARN thích hợp.

- Mẫu ARN thu được sau tách chiết lưu trong ống ly tâm không chứa DNase/RNase (5.2.2) để tiến hành xét nghiệm các chỉ tiêu.

- Mẫu ARN được bảo quản ở 2 °C đến 8 °C (5.1.8) nếu tiến hành xét nghiệm ngay hoặc bảo quản ở âm 20 °C (5.1.9) chờ đến khi tiến hành xét nghiệm.

7.2.1.2  Thực hiện phản ứng real-time RT-PCR

- Chuẩn bị cặp mồi, mẫu dò xác định vi rút CGC A/H9N2 ở nồng độ sử dụng thích hợp (tham khảo các bằng C.2, bảng C.3, bảng C.4, phụ lục C) với nước tinh khiết không chứa DNase/RNase (4.2.5).

- Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng nhân gen theo hướng dẫn của bộ kit được sử dụng (tham khảo các bảng C.2, bảng C.3, bảng C.4, phụ lục C).

+ Chuyển 20 µl hỗn hợp phản ứng nhân gen vào mỗi ống PCR 0,1 đến 0,2 ml (5.2.4)

+ Cho 5 µl mẫu ARN chuẩn dương (4.2.6) có giá trị Ct đã biết trước vào ống PCR đối chứng dương.

+ Cho 5 µl nước tinh khiết không có DNase/RNase (4.2.5) vào ống PCR đối chứng âm.

+ Cho 5 µl mẫu ARN kiểm tra vào ống PCR.

- Ly tâm lắng ống phản ứng trong khoảng 30 giây bằng máy ly tâm lắng (5.1.5).

- Cài đặt chu trình nhiệt chạy phản ứng real-time RT-PCR trên máy nhân gen (5.2.3) (tham khảo các bảng C.5, bảng C.6, bảng C.7, phụ lục C) tùy thuộc vào mục tiêu subtype CGC cần phát hiện.

- Đặt ống PCR chứa hỗn hợp phản ứng vào máy nhân gen (5.2.3) và chạy máy theo chương trình đã cài đặt.

Đọc kết quả

Kết quả của phản ứng real-time PCR được xác định dựa vào chu kỳ ngượng (Cycle threshold: Ct)

- Điều kiện phản ứng được công nhận: Mẫu đối chứng dương tính (được chuẩn độ trước), cho kết quả dương dính và có giá trị Ct tương đương giá trị Ct đã biết (± 2), mẫu đối chứng âm tính không có giá trị Ct.

+ Nếu một trong số mẫu đối chứng là không đúng thì phản ứng không được công nhận và phải thực hiện lại xét nghiệm.

- Với điều kiện phản ứng trên:

+ Mẫu có giá trị Ct ≤ 40 được coi là dương tính (nếu chạy chu trình nhiệt là 45 vòng).

Ct ≤ 35 được coi là dương tính (nếu chạy chu trình nhiệt là 40 vòng).

- Mẫu không có giá trị Ct được coi là âm tính.

- Mẫu có giá trị Ct trong khoảng 40 < Ct ≤ 45 được coi là nghi ngờ (nếu chạy chu trình nhiệt là 45 vòng), hoặc trong khoảng 35 < Ct ≤ 40 được coi là nghi ngờ (nếu chạy chu trình nhiệt là 40 vòng).

Những mẫu nghi ngờ cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm tương đương khác để khẳng định kết quả.

7.2.2  Phân lập trên phôi trứng

Tất cả các thao tác trong phương pháp phân lập phải được thực hiện trong phòng thử nghiệm an toàn sin học cấp III.

7.2.2.1  Chuẩn bị mẫu

Mẫu bệnh phẩm được xử lý (7.1.3), lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 µm (5.3.2) để loại bỏ vi khuẩn trước khi tiêm truyền trên phôi trứng.

7.2.2.2  Tiêm truyền

- Chọn trứng gà SPF hoặc trứng gà SAN có phôi 9 ngày đến 11 ngày tuổi (4.3.1) để tiêm truyền huyễn dịch bệnh phẩm đã lọc vô trùng (7.2.2.1).

- Mỗi bệnh phẩm tiêm truyền từ 3 - 5 trứng.

- Xác định túi niệu mô và buồng hơi của phôi trứng. Đục thủng buồng hơi, dùng bơm tiêm 1 ml (5.3.3) với kim 23G (5.3.4) hút huyễn dịch đã xử lý (7.2.2.1) tiêm thẳng xuống túi niệu mô với lượng 0,1 ml/ trứng. Bịt kín lỗ tiêm trên vỏ trứng bằng keo dán.

- Đặt trứng trong tủ ấp trứng (5.3.1) ở 37 °C (± 0,5 °C đến 1 °C) và theo dõi trong vòng 2-7 ngày.

- Soi trứng mỗi ngày 2 lần, nếu phát hiện trứng chết, cất trứng ở 2 °C đến 8 °C (5.1.8) cho đến khi thu hoạch dịch niệu mô để giám định vi rút, nên thu hoạch sớm trong vòng 12 giờ sau khi phát hiện trứng chết để tránh nhiễm khuẩn dịch niệu mô.

- Đối với trứng không chết sau 5 - 7 ngày, cất ở 2 °C đến 8 °C (5.1.8) qua đêm hoặc ít nhất 4 h trước khi thu hoạch dịch niệu mô cho giám định vi rút.

7.2.2.3  Thu hoạch dịch niệu mô

- Sát trùng vỏ trứng bằng cồn tuyệt đối (4.1.1), đánh dấu vị trí buồng hơi

- Dùng panh và kéo vô trùng (5.1.10) cắt vỏ trứng ở vị trí buồng hơi, bộc lộ buồng hơi.

- Dùng bơm tiêm 5 ml hoặc 10 ml (5.3.3) với kim 20G (5.3.4) chọc qua lớp màng xoang niệu mô hút lấy dịch niệu mô chứa vào các ống 15 ml vô trùng (5.1.2) để giám định vi rút.

- Kiểm tra bệnh tích của phôi: trường hợp mẫu âm tính hoặc vi rút độc lực thấp, hàm lượng vi rút thấp, phôi sẽ không có biểu hiện bệnh tích.

Trường hợp mẫu có vi rút cúm độc lực cao, phôi sẽ có xuất huyết lấm tấm trên đầu, thân, cánh, chân.

7.2.2.4  Giám định vi rút

- Tiến hành xác định sự có mặt của vi rút gây ngưng kết hồng cầu trong dịch niệu mô bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu HA (xem phụ lục E).

- Giám định các mẫu dịch niệu mô dương tính HA bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) với kháng thể kháng vi rút CGC subtype H9 chuẩn (4.3.5) (xem phụ lục F)

- Hoặc giám định sự có mặt vi rút CGC trong dịch niệu mô bằng phương pháp real-time RT-PCR với cặp mồi/mẫu dò tương ứng với từng subtype (xem 7.2.1).

- Với những mẫu dịch niệu mô sau khi giám định là âm tính cần tiến hành tiêm truyền lại một lần nữa trên phôi trứng như trên để xác nhận lại.

7.2.2.5  Đánh giá kết quả

- Mẫu dương tính: khi có kết quả xét nghiệm dương tính bằng phương pháp HI với subtype H9, hoặc phương pháp real-time RT-PCR với vi rút CGC A/H9N2.

- Mẫu âm tính: Khi có kết quả âm tính với phương pháp HA, hoặc phương pháp real-time RT-PCR với vi rút CGC type A.

Trong trường hợp giám định âm tính, dùng dịch niệu mô thu hoạch ở lần thứ nhất để tiêm truyền trứng lần hai. Sau đó theo dõi và thu hoạch dịch niệu mô như lần thứ nhất để giám định vi rút. Nếu kết quả giám định lần thứ hai vẫn âm tính, thì kết luận mẫu âm tính với vi rút CGC.

7.3  Phát hiện kháng thể

7.3.1  Xử lý mẫu

Huyết thanh kiểm tra: Ngoại trừ huyết thanh gà, trước khi xét nghiệm huyết thanh của các loài (không phải là gà) như vịt, ngan, ngỗng...cần được vô hoạt bổ thể ở 56 °C trong 30 phút bằng máy ủ nhiệt (5.3.6) và phải xử lý hấp phụ hồng cầu để tránh hiện tượng ngưng kết giả..

Cách hấp phụ huyết thanh bằng hồng cầu gà: trộn huyết thanh + dung dịch PBS + hồng cầu gà 10 % theo tỷ lệ 1:2:1 và giữ ở nhiệt độ 4 °C trong 60 phút hoặc qua đêm. Ví dụ 50 µl huyết thanh + 100 PBS + 50 µl hồng cầu gà 10 %. Sau khi hấp phụ, thu lấy dịch huyết thanh ở trên để làm phản ứng HI và huyết thanh sẽ có hiệu giá pha loãng 1/4.

7.3.2.  Phương pháp ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)

Xem Phụ lục F.

7.3.3  Đọc kết quả

- Phản ứng dương tính: hồng cầu lắng xuống đáy, khi nghiêng đĩa phản ứng tạo dòng chảy liền mạch, chứng tỏ kháng nguyên và kháng thể tương ứng.

- Phản ứng âm tính: hồng cầu ngưng kết lấm chấm, không chảy thành dòng, chứng tỏ không có kháng thể thích hợp kết hợp với kháng nguyên tương ứng trong phản ứng.

Hiệu giá kháng thể được tính ở độ pha loãng cao nhất còn có hiện tượng ức chế ngưng kết hồng cầu hoàn toàn.

Mẫu huyết thanh được coi là dương tính với kháng thể kháng vi rút cúm gia cầm khi có hiệu giá HI ≥ 1/16 (4log2).

Mẫu huyết thanh được coi là âm tính (không có kháng thể) khi có hiệu giá kháng thể HI ≤ 1/8 (3 log2).

8  Kết luận

- Gia cầm, thủy cầm hoặc chim hoang đã được xác định mắc bệnh cúm A/H9N2 khi có các đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích của bệnh CGC và có kết quả xét nghiệm dương tính với phương pháp real-time RT-PCR, hoặc phân lập vi rút trên trứng trong tiêu chuẩn này.

- Gia cầm, thủy cầm hoặc chim hoang có kết quả dương tính kháng thể H9 bằng phương pháp HI được coi là nhiễm vi rút CGC A/H9 (khi gia cầm chưa tiêm phòng vắc xin phòng cúm gia cầm).

Phụ lục A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị dung dịch thuốc thử

A.1  Dung dịch muối đệm phốt phát (PBS) pH ≈ 7,4 ± 0,2.

Thành phần

Cách chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên trong 1 000 ml nước cất. Chỉnh pH trong khoảng 7,4 ± 0.2. Hấp bằng nồi hấp (5.1.6) ở 121 °C trong 15 phút, bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C (5.1.8), sử dụng tốt nhất trong 2 tuần.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng PBS thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất

A.2  Dung dịch natri citrate 4 %

Thành phần

Cách chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong 100 ml nước cất, lọc vô trùng bằng màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 µm (5.3.2). Bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C (5.1.8).

Phụ lục B

(Tham khảo)

Quy trình tách chiết ARN

Hiện nay có rất nhiều loại kit tách chiết khác nhau được cung cấp trên thị trường. Do vậy tùy thuộc vào điều kiện thực tế của phòng thử nghiệm để lựa chọn nguyên liệu tách chiết ARN thích hợp.

Ví dụ như sử dụng kít tách chiết TACO DNA/RNA Extraction Kit (GeneReach Cat. No. atc-d/rna) thì có thể thực hiện theo các bước sau hoặc có thể sử dụng các bộ kit khác nếu cho kết quả tương đương

B.1  Nguyên liệu

- Bộ kít tách chiết TACO DNA/RNA extraction kit (GeneReach Cat. No. atc-d/rna)1).

- Ethanol tuyệt đối (4.1.1)

B.2  Cách tiến hành

Quy trình tách chiết theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Pha dung dịch đệm rửa (washing buffer A) với 135 ml ethanol tuyệt đối.

- Pha dung dịch đệm rửa (washing buffer B) với 230 ml ethanol tuyệt đối.

- Tiến hành nhỏ các dung dịch cho việc tách chiết theo sơ đồ:

- Cho 200 µl huyễn dịch mẫu đã được xử lý (7.1.3) sau khi ly tâm vào các giếng ở cột 1 hoặc cột 7.

- Chuẩn bị máy tách chiết (5.2.1): khởi động, cài lược sạch vào máy.

- Đặt đĩa đã nhỏ mẫu và dung dịch ở trên vào máy Taco và cho máy chạy.

- Sau khi máy chạy xong, thu 100 µl ARN từ các giếng tại cột 6 hoặc 12 sang các ống ly tâm (5.2.2) mới để tiến hành xét nghiệm.

Phụ lục C

(Tham khảo)

Trình tự cặp mồi, mẫu dò, thành phần phản ứng và chu trình nhiệt cho phản ứng real- time RT-PCR phát hiện CGC A/H9N2

C.1  Nguyên liệu

- Nước tinh khiết không có Drisae/Rnase (4.2.5)

- Dung dịch đệm TE (4.2.4)

- Cặp mồi và mẫu dò phát hiện vi rút CGC A/H9N2

- Nguyên liệu nhân gen real-time RT-PCR (4.2.2)

Ví dụ như sử dụng kit nhân gen Quantabio qScriptXLT 1-Step RT-qPCR ToughMix (95132-500)2) hoặc có thể sử dụng các bộ kit khác nếu cho kết quả tương đương phù hợp nhân gen real-time RT-PC”

C.2  Trình tự cặp mồi, mẫu dò cho phương pháp real-time RT-PCR

Bảng C.1 - Cặp mồi và mẫu dò phát hiện vi rút CGC A/H9N2

CHÚ THÍCH:

1) Việc lựa chọn các mồi và mẫu dò cho phản ứng real-time RT-PCR cần tham khảo theo hướng dẫn của Tổ chức Thú y Thế giới (OIE/WOAH), hoặc quy trình của phòng thử nghiệm tham chiếu của OIE về bệnh, đồng thời cần được đánh giá trên các mẫu chuẩn để cập nhật mồi cho phù hợp.

2) Trong trường hợp vi rút có biến đổi về cấu trúc gen và không phát hiện được với cặp mồi/ mẫu dò như trong Bảng C.2, phòng thử nghiệm cần gửi mẫu giải trình tự gen để xác định sự thay đổi về trình tự gen HA và lựa chọn trình tự mồi/ mẫu dò phù hợp.

C.3  Thực hiện phản ứng nhân gen real-time RT-PCR

C.3.1  Chuẩn bị cặp mồi và mẫu dò

- Hoàn nguyên: Mồi và mẫu dò ở trạng thái đông khô được ly tâm nhanh (5.1.5) để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Dùng dung dịch đệm TE (4.2.4) để hoàn nguyên mồi và mẫu dò ở nồng độ 100 µm làm mồi gốc và mẫu dò gốc.

- Pha nồng độ sử dụng: Chuẩn bị mồi sử dụng ở nồng độ 20 µM, mẫu dò sử dụng ở nồng độ 6 µm được pha loãng từ mồi gốc, mẫu dò gốc bằng nước tinh khiết không có Dnase/RNase (4.2.5)

Ví dụ: lấy 20 µl mồi gốc có nồng độ 100 µM và thêm 80 µl nước tinh khiết (4.2.5) sẽ được mồi sử dụng có nồng độ 20 µM / µl.

Ví dụ: lấy 6 µl mẫu dò gốc có nồng độ 100 µM và thêm 94 µl nước tinh khiết (4.2.5) sẽ được mẫu dò sử dụng có nồng độ 6 µm / µl.

C.3.2  Cách tiến hành

Thành phần và lượng cho 1 phản ứng xem bảng C.2 hoặc bảng C.3 hoặc bảng C.4.

Chu trình nhiệt xem bảng C.5 hoặc C.6 hoặc bảng C.7.

Bảng C.2 - Thành phần phản ứng real-time RT-PCR phát hiện vi rút CGC type A

Bảng C.3 - Thành phần phản ứng real-time RT-PCR phát hiện vi rút CGC subtype H9

Bảng C.4 - Thành phần phản ứng real-time RT-PCR phát hiện vi rút CGC subtype N2

Bảng C.5 - Chu trình nhiệt phản ứng real-time RT-PCR phát hiện vi rút CGC type p

CHÚ THÍCH: Chu trình nhiệt của phản ứng real-time RT-PCR có thể thay đổi tùy theo từng loại kit nhân gen sử dụng và nhiệt độ bắt cặp của từng cặp mồi/mẫu dò. Phòng thử nghiệm cần tối ưu phản ứng trước khi đưa vào áp dụng.

Bảng C.6 - Chu trình nhiệt phản ứng real-time RT-PCR phát hiện vi rút CGC subtype H9

CHÚ THÍCH: Chu trình nhiệt của phản ứng real-time RT-PCR có thể thay đổi tùy theo từng loại kit nhân gen sử dụng và nhiệt độ bắt cặp của từng cặp mồi/mẫu dò. Phòng thử nghiệm cần tối ưu phản ứng trước khi đưa vào áp dụng.

Bảng C.7 - Chu trình nhiệt phản ứng real-time RT-PCR phát hiện vi rút CGC subtype N2

CHÚ THÍCH: Chu trình nhiệt của phản ứng real-time RT-PCR có thể thay đổi tùy theo từng loại kit nhân gen sử dụng và nhiệt độ bắt cặp của từng cặp mồi/mẫu dò. Phòng thử nghiệm cần tối ưu phản ứng trước khi đưa vào áp dụng.

Phụ lục D

(Quy định)

Chuẩn bị hồng cầu gà 1 %

D.1 Nguyên liệu và dụng cụ

- Gà lấy máu là gà đã trưởng thành, khỏe mạnh âm tính kháng thể CGC, Niu cát xơn, và được nuôi ở chuồng an toàn dịch bệnh.

- Bơm tiêm 5 ml -10 ml (5.3.3) và kim tiêm vô trùng 23G (5.3.4)

- Dung dịch chống đông: natri citrate 4% (xem A.2, phụ lục A)

- Dung dịch PBS (xem A.1, phụ lục A)

- Máy ly tâm và các dụng cụ phòng thử nghiệm khác.

D.2  Chuẩn bị hồng cầu

- Sát trùng vị trí lấy máu (tĩnh mạch cánh hoặc tim) bằng bông cồn 70 %. Dùng bơm tiêm từ 5 ml đến 10 ml có gắn kim tiêm 23G hút khoảng 1 ml dung dịch chống đồng (natri citrate 4 %) (xem A.2, phụ lục A) để lấy máu gà. Cho máu vào ống vô trùng 50 ml (5.1.2).

Ghi chú: Tỷ lệ tối thiểu của dung dịch natri citrate và máu là 1:4

- Rửa hồng cầu:

+ Cho PBS vào ống vô trùng chứa máu, một lượng gấp đôi lượng máu trong ống, lắc đều nhẹ nhàng. Ly tâm ống máu ở 1 500 g trong 10 phút, bỏ huyết tương ở trên.

+ Rửa như trên từ 2 lần đến 3 lần. Sau lần ly tâm cuối, bỏ nước ở trên, lấy hồng cầu để pha thành hồng cầu 1 %.

Hồng cầu gà đặc                                   1 ml

Dung dịch PBS (pH ~ 7,4)                      99 ml

Lắc đều nhẹ, sử dụng trong 1 ngày đến 2 ngày. Bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C (5.1.8).

Phụ lục E

(Quy định)

Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA)

Phương pháp này chủ yếu áp dụng để xác định các subtype kháng nguyên H gây ngưng kết hồng cầu của vi rút CGC, không áp dụng để xác định các subtype kháng nguyên N.

E.1  Nguyên liệu và dụng cụ

- Hồng cầu gà 1 % (xem phụ lục D)

- Dịch niệu mô thu hoạch sau phân lập (hoặc kháng nguyên chuẩn vi rút CGC subtype H9 (4.3.4))

- Dung dịch PBS (xem A.1, phụ lục A)

- Đĩa nhựa 96 giếng đáy chữ V (5.3.5)

- Micropipet đơn kênh, đa kênh (5.1.11) và đầu tip tương ứng (5.1.12)

E.2  Tiến hành phản ứng

Phản ứng được tiến hành trên dĩa nhựa 96 giếng đáy chữ V. Thực hiện phản ứng theo sơ đổ tại Bằng E.1

Bảng E.1 - Sơ đồ phản ứng ngưng kết hồng cầu HA

- Cho 25 µl dung dịch PBS vào các giếng của đĩa nhựa 96 giếng đáy V

- Cho 25 µl dịch kháng nguyên vi rút vào giếng đầu tiên của đĩa nhựa 96 giếng đã nhỏ PBS ở trên.

- Pha loãng kháng nguyên vi rút theo hệ số 2: Trộn đều kháng nguyên với PBS ở giếng 1, hút 25 µl từ giếng 1 và chuyển sang giếng thứ 2 và trộn đều, tiếp tục làm như vậy đến giếng 11 và sau khi trộn đều ở giếng này thì loại bỏ 25 µl. Giếng 12 chỉ có PBS để làm đối chứng hồng cầu.

- Thêm 25 µl dung dịch PBS vào tất cả các giếng.

- Thêm 25 µl dung dịch hồng cầu gà 1 % vào tất cả các giếng. Gõ nhẹ đĩa, đậy nắp, để đĩa ở nhiệt độ phòng, tức 20 °C trong 40 phút hoặc 4 °C trong 60 phút để hồng cầu lắng.

E.3  Đọc kết quả: nghiêng đĩa quan sát dòng chảy của hồng cầu

+ Phản ứng dương tính: có hạt hồng cầu ngưng kết lấm chấm, không chảy thành dòng

+ Phản ứng âm tính: Hồng cầu lắng xuống đáy tạo thành chấm tròn, khi nghiêng đĩa sẽ tạo dòng chảy liền mạch của hồng cầu.

Hiệu giá ngưng kết HA hoàn chỉnh được tính ở độ pha loãng kháng nguyên cao nhất còn xuất hiện ngưng kết hoàn toàn (không có dòng chày hồng cầu).

Ví dụ: giếng thứ 8 là giếng cuối cùng còn có ngưng kết hoàn toàn, vậy hiệu giá HA = 1/256 (hay 8 log2).

E.4  Đánh giá kết quả

- Phản ứng HA dương tính: Kết luận có vi rút gây bệnh. Để xác định là vi rút CGC cần phải giám định bằng phản ứng HI với kháng huyết thanh dương tính chuẩn tương ứng với từng subtype, hoặc bằng phương pháp real-time RT-PCR (xem 7.2.1).

- Phản ứng HA âm tính: Có thể trong bệnh phẩm không có mặt vi rút cúm gia cầm hoặc lượng vi rút quá ít. Vì vậy, cần tiếp tục tiêm truyền phôi trứng lần 2 (dùng nước trứng thu hoạch lần 1 để tiêm truyền).

Phụ lục F

(Quy định)

Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)

Phương pháp này chủ yếu áp dụng để xác định các subtype kháng nguyên H gây ngưng kết hồng cầu của vi rút CGC, không áp dụng để xác định các subtype kháng nguyên N.

Với subtype kháng nguyên N đòi hỏi chuyên môn và thuốc thử chuyên biệt, thường chỉ thực hiện tại các phòng thử nghiệm tham chiếu của OIE.

F.1  Nguyên liệu và dụng cụ

- Hồng cầu gà 1 % (phụ lục D)

- Dung dịch PBS (xem A.1, phụ lục A)

- Huyết thanh chuẩn dương tính và âm tính với subtype H9 (4.3.5)

- Huyết thanh cần kiểm tra.

- Kháng nguyên chuẩn subtype H9 (4.3.4) và 4 HAU của kháng nguyên.

- Đĩa nhựa 96 giếng đáy chữ V (5.3.5)

- Micropipet đơn kênh, đa kênh (5.1.11) và đầu tip tương ứng (5.1.12)

F.2  Pha 4 HAU và chuẩn độ kháng nguyên 4 HAU

- Thực hiện phản ứng HA (xem phụ lục E) để xác định hiệu giá kháng nguyên.

- Pha 4 HAU từ hiệu giá ngưng kết kháng nguyên HA đã biết với PBS.

Ví dụ: nếu sự ngưng kết của kháng nguyên vi rút kiểm tra ở độ pha loãng 8 log2 tức HA = 1/256 thì 4 đơn vị kháng nguyên (4 HAU) được pha loãng là 1/64 (256/4 = 64). Pha 4 HAU gồm 1 phần kháng nguyên và 63 phần PBS.

- Chuẩn độ lại kháng nguyên 4 HAU đã pha bằng phản ứng HA, đạt yêu cầu mới được dùng tiếp cho phản ứng HI.

Nếu chuẩn độ lại 4 HAU có kết quả ngưng kết đến giếng thứ 2, như vậy 4 HAU đã pha đạt yêu cầu. Nếu ngưng kết ở giếng thứ 3 hoặc hơn là kháng nguyên đặc, cần bổ sung thêm PBS để có kháng nguyên 4 HAU chuẩn.

Nếu ngưng kết ở giếng đầu tiên là kháng nguyên loãng, cần bổ sung thêm kháng nguyên để đạt 4 HAU chuẩn.

F.3  Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)

Phản ứng được tiến hành trên đĩa nhựa 96 giếng đáy chữ V, Thực hiện phản ứng theo sơ đồ tại Bảng F.1

- Cho 25 µl dung dịch PBS vào các giếng của đĩa nhựa 96 giếng đáy V.

- Cho tiếp 25 µl huyết thanh của mẫu cần kiểm tra vào giếng đầu tiên của đĩa chữ V ở trên.

- Pha loãng huyết thanh theo hệ số 2 trên toàn bộ dĩa: hút 25 µl từ giếng 1 và chuyển sang giếng thử 2 và trộn đều, tiếp tục làm như vậy đến giếng 11 và sau khi trộn đều ở giếng này thì loại bỏ 25 µl

- Riêng cột 12 dùng làm đối chứng hồng cầu cho mỗi đĩa phản ứng.

- Cho 25 µl kháng nguyên 4HA vào tất cả các giếng trừ cột 12. Cột 12 bổ sung 25 µl PBS.

- Gõ nhẹ đĩa, đậy nắp, để đĩa ở nhiệt độ phòng, tức 20 °C trong tối thiểu 30 phút hoặc 4 °C trong 60 phút.

- Thêm 25 µl dung dịch hồng cầu gà 1 % vào tất cả các giếng. Gõ nhẹ đĩa, đậy nắp, để dĩa ở nhiệt độ phòng, tức 20 °C trong 40 phút hoặc 4 °C trong 60 phút để hồng cầu lắng.

Bảng F.1 - Sơ đồ phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu HI

CHÚ THÍCH:

1) Khi thực hiện phản ứng thì tiến hành đồng thời cả mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm (với hiệu giá đã biết). Quy trình thực hiện như mẫu huyết thanh kiểm tra (không cần phải xử lý huyết thanh).

2) Hiệu giá kháng thể HI có thể thay đổi khi sử dụng vi rút chuẩn khác nhau, vì vậy cần lựa chọn chủng vi rút chuẩn có tính tương đồng về kháng nguyên so với vi rút vắc xin.

F.4  Đọc kết quả: sau 40 phút khi đối chứng hồng cầu đã lắng, nghiêng đĩa quan sát dòng chảy của hồng cầu.

+ Phản ứng dương tính: Hồng cầu tạo dòng chảy liền mạch giống như giếng đối chứng hồng cầu tại cột 12.

+ Phản ứng âm tính: hồng cầu ngưng kết lấm chấm, không chảy thành dòng.

Hiệu giá HI được tính ở độ pha loãng cao nhất của huyết thanh gây ức chế hoàn toàn 4HAU của kháng nguyên.

- Kết quả hợp lệ khi:

Huyết thanh đối chứng âm tính chuẩn cố hiệu giả HI nhỏ hơn 1:4 (2 log2).

Huyết thanh đối chứng dương tính chuẩn có hiệu giá HI bằng với hiệu giá kháng thể đã biết trước đó ±01 độ pha loãng (1:2).

- Đánh giá kết quả:

+ Mẫu huyết thanh được coi là âm tính nếu có hiệu giá kháng thể HI ≤ 1: 8.

+ Mẫu huyết thanh được coi là dương tính nếu có hiệu giá kháng thể HI < 1:16. Điều này có nghĩa là mẫu huyết thanh có chứa kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên của vi rút chuẩn đã dùng.

Phụ lục G

Sơ đồ chẩn đoán bệnh CGC A/H9N2

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 8400 - 26:2014. Bệnh động vật - Quy trình Chẩn đoán. Phần 26: Bệnh cúm gia cầm.H5N1.

[2] CSIRO Animal. Food and Health Sciences (CAFHS) Australian Animal Health Laboratory (AAHL), AI H9 Realtime PCR method. OFFLU/OIE/FAO. PCR assays - validation, https://www.offlu.org.

[3] Akshalova P. B., Andriyasov A. V., Scherbakova L. O., Kolosov S. N., Zinyakov N. G., Chvala I. A., Andreychuk D. B. Development of real-time RT-PCR for N2 subtype avian influenza RNA-virus detection. Veterinary Science Today. 2020; 3 (34): 186-192. DOI: 10.29326/2304-196X-2020-3-34- 186-192.

[4] OIE Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals (2021). CHAPTER 3.3.4. Avian Influenza. https://www.woah.org/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.03.04_Al.pdf.

[5] Bóna, M.; Foldi, J.; Dénes, L.; Harnos, A.; Paszerbovics, B.; Mándoki, M. Evaluation of the Virulence of Low Pathogenic H9N2 Avian Influenza Virus Strains in Broiler Chickens. Vet. Sci. 2023, 10, 671. https://doi.org/10.3390/ vetsci10120671.

[6] Fouchier, R., & Munster, VJ. (2009). Epidemiology of low pathogenic avian influenza viruses In wild birds. Revue Scientifique et Technique de I'Office International des Epizooties, 28(1), 49-58.

[7] Monne, I., Ormelli, S., Salviato, A., De Battisti, C., Bettini, F., Salomoni, A., Cattoli, G. (2008). Develoµment and Validation of a One-Step Real-Time PCR Assay for Simultaneous Detection of Subtype H5, H7, and H9 Avian Influenza viruses. Journal of Clinical Microbiology, 46(5), 1769- 1773. doi:10.1128/jcm.02204-07.

[8] Peacock, T. P., James, J., Sealy, J. E., & Iqbal, M. (2019). A Global Perspective on H9N2 Avian Influenza Virus. Viruses; 11(7), 620. doi:10.3390/v11070620.

[9] Yang, J., Müller, N. F., Bouckaert, R., Xu, B., & Drummond, A. J. (2019). Bayesian phylodynamics of avian influenza A virus H9N2 in Asia with time-dependent predictors of migration. PLOS Computational Biology, 15(8), e1007189. doi:10.1371/journal.pcbi.1007189.