TCVN 8669-6:2011

QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VẮC XIN -

PHẦN 6: VẮC XIN GUMBORO NHƯỢC ĐỘC

Vaccine testing procedure - Part 6: Infectious bursal disease vaccine, live

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định yêu cầu kỹ thuật đối với vắc xin sản xuất từ phôi gà hoặc tế bào đã được gây nhiễm bằng một chủng vi rút Gumboro nhược độc hoặc vô độc tự nhiên, dạng đông khô.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 8684:2011, Vắc xin và chế phẩm sinh học dùng trong thú y - Phép thử độ thuần khiết.

3. Lấy mẫu sản phẩm và chuẩn bị động vật thí nghiệm

3.1 Lấy mẫu sản phẩm

Lấy mẫu sản phẩm theo quy định trong Bảng 1 như sau:

Bảng 1 - Số lượng mẫu vắc xin dạng đông khô cần lấy

3.2 Chuẩn bị động vật thí nghiệm

Chuẩn bị:

- 45 gà 1 ngày tuổi đến 1 tuần tuổi, mẫn cảm, khỏe mạnh;

- 10 trứng gà có phôi từ 9 ngày tuổi đến 10 ngày tuổi;

- Tế bào xơ phôi gà, được sản xuất từ trứng gà có phôi từ 9 ngày tuổi đến 10 ngày tuổi.

4. Quy trình kiểm nghiệm

4.1 Kiểm tra cảm quan

Kiểm tra bằng mắt thường: vắc xin phải có màu trắng hồng hoặc vàng nhạt, dạng bánh xốp, dễ tách khỏi thành lọ.

4.2 Kiểm tra độ thuần khiết

4.2.1 Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn, theo TCVN 8684:2011.

4.2.2 Kiểm tra tạp nhiễm nấm mốc, theo TCVN 8684:2011.

4.2.3 Kiểm tra tạp nhiễm Salmonella, theo TCVN 8684:2011.

4.2.4 Kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma, theo TCVN 8684:2011.

4.2.5 Kiểm tra tạp nhiễm Newcastle

Kiểm tra tạp nhiễm Newcastle bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu (Haemagglutination test - HA). Phản ứng được tiến hành trên đĩa 96 giếng đáy tròn bố trí như Bảng 2.

- Cho 50 µl nước sinh lý vào các giếng từ A1 đến D12.

- Cho 50 µl vắc xin đã được hoàn nguyên theo hướng dẫn vào A1, B1 pha loãng theo cơ số 2 như sơ đồ. 2 dãy C1 - D12 dùng làm đối chứng hồng cầu.

- Cho 50 µl hồng cầu gà 1 % vào các giếng từ A1 đến D12, ủ ở nhiệt độ phòng.

- Đọc kết quả sau 20 min đến 30 min. Phản ứng âm tính nếu hồng cầu gà lắng xuống đáy ống thành một cục máu tròn đỏ, nước ở trên trong. Phản ứng dương tính nếu hồng cầu ngưng kết hoàn toàn thành những hạt lấm tấm màu đỏ (thành quầng đỏ rạn nứt ở đáy giếng, hiệu giá ngưng kết đọc ở giếng ngưng kết cuối cùng, trước giếng không ngưng kết).

- Lô vắc xin được coi là đạt nếu âm tính với phản ứng ngưng kết hồng cầu.

4.3 Kiểm tra tính an toàn

Nhỏ mắt (hoặc uống) cho 15 gà 1 ngày tuổi mẫn cảm, khỏe mạnh, mỗi con 10 liều vắc xin ghi trên nhãn. Theo dõi trong 21 ngày.

Lô vắc xin được coi là đạt nếu gà sống khỏe, không có triệu chứng, bệnh tích của bệnh Gumboro.

4.4 Kiểm tra hiệu lực

4.4.1 Phương pháp trọng tài (phương pháp công cường độc)

- Tiêm cho 20 gà mẫn cảm, khỏe mạnh, mỗi con 1 liều vắc xin ghi trên nhãn.

- Sau 10 ngày đến 14 ngày, gà miễn dịch cùng 10 gà đối chứng được thử thách với vi rút cường độc IBDV liều 10² TCID₅₀. Theo dõi từ 3 ngày đến 10 ngày sau khi công cường độc.

- Lô vắc xin được coi là đạt nếu ít nhất 80 % gà đối chứng có bệnh tích của Gumboro và ít nhất 80 % gà miễn dịch không có bệnh tích của bệnh Gumboro.

4.4.2 Phương pháp thay thế

4.4.2.1 Phương pháp chuẩn độ vi rút TCID₅₀ (tissue culture infective dose)

4.4.2.1.1 Chuẩn bị tế bào xơ phôi gà trên đĩa 96 giếng

Pha trypsin tế bào xơ phôi gà thành huyễn dịch tế bào có đậm độ 5 x 10³ tế bào/ml. Cho 100 µl huyễn dịch tế bào trên vào tất cả các giếng. Đậy nắp, ủ tế bào ở 37 ⁰C có 5 % CO₂, theo dõi hàng ngày.

Khi tế bào bám đáy đạt trên 80 % thì tiến hành chuẩn độ vi rút.

4.4.2.1.2 Chuẩn độ vi rút

- Hoàn nguyên vắc xin (vi rút kháng nguyên) thành 1 liều/1ml.

- Pha loãng vắc xin trong ống nghiệm theo cơ số 10 bằng môi trường nuôi cấy tế bào từ 10^-1 đến 10^-8. - Lấy đĩa tế bào xơ phôi gà đã nuôi, loại bỏ môi trường cũ.

- Rửa tế bào bằng PBS (-), 200 µl/giếng, sau đó loại bỏ PBS (-)

- Hút 100 µl huyễn dịch vi rút đã pha loãng lần lượt vào các giếng tương ứng trên đĩa tế bào (từ A1 đến H5), dãy đối chứng tế bào (từ A6 đến H6),cho 100 µl môi trường duy trì vào mỗi giếng.

- Ủ tế bào ở 37 ⁰C có 5 % CO₂ trong 30 min.

- Loại bỏ huyễn dịch trong các giếng.

- Rửa tế bào bằng PBS (-), 200 µl/giếng, loại bỏ PBS (-). - Cho 200 µl môi trường duy trì vào mỗi giếng.

- Nuôi tế bào ở 37 ⁰C có 5 % CO₂, theo dõi hàng ngày, trong 5 ngày. - Đọc kết quả: giếng có bệnh tích tế bào là dương tính.

λ.TCID₅₀ (0,1 ml) = X + 1/2 - (N_x/n)

trong đó:

X là logarit cơ số 10 của độ pha loãng vi rút có 100 % giếng xuất hiện bệnh tích tế bào; Nx là tổng số giếng có bện tích tế bào trong thí nghiệm;

n là số giếng của mỗi độ pha loãng;

λ là độ pha loãng vi rút.

- Kết quả: Vắc xin được coi là đạt nếu mỗi liều vắc xin có ít nhất 103 TCID50.

4.4.2.2 Phương pháp trung hòa vi rút (virus neutranization test - VNT)

4.4.2.2.1 Chuẩn bị tế bào xơ phôi gà trên đĩa 96 giếng

Xem 4.4.2.1.1.

4.4.2.2.2 Chuẩn độ vi rút

Xem 4.4.2.1.2.

4.4.2.2.3 Cách tiến hành

- Pha loãng huyết thanh miễn dịch theo cơ số 2, từ 1/2 đến 1/1024 trong môi trường nuôi cấy tế bào.

- Trung hòa: lấy 100 µl huyết thanh đã được pha loãng ở các nồng độ bổ sung 100 µl huyễn dịch vi rút có chứa 100 TCID₅₀, ủ 30 min ở nhiệt độ phòng.

- Hút bỏ dịch nuôi trong đĩa tế bào: hút 100 µl huyễn dịch huyết thanh - vi rút đã được trung hòa vào các giếng trong đĩa tế bào tương ứng theo sơ đồ:

- Ủ tế bào ở 37 ⁰C có 5 % CO₂ trong 60 min.

- Loại bỏ huyễn dịch trong các giếng.

- Rửa tế bào bằng PBS (-), 200 µl/giếng, loại bỏ PBS (-) - Cho 200 µl môi trường duy trì vào mỗi giếng.

- Nuôi tế bào ở 37 ⁰C có 5 % CO₂, theo dõi hàng ngày, trong 5 ngày. - Đọc kết quả: giếng có bệnh tích tế bào là dương tính.

- Kết quả: Huyết thanh đạt hiệu giá ít nhất 1/256.